巴马小型猪冠状动脉微栓塞后白细胞介素-1受体相关激酶1、肿瘤坏死因子受体相关因子6及AU碱基富集区RNA结合因子1 mRNA的表达及意义▲

林士云 曾志羽 马国添 吴 海 夏炳辉 阮 翔

(广西医科大学第一附属医院老年心内科，南宁市 530021，E-mail：447922897@qq.com)

论著·基础研究

巴马小型猪冠状动脉微栓塞后白细胞介素-1受体相关激酶1、肿瘤坏死因子受体相关因子6及AU碱基富集区RNA结合因子1 mRNA的表达及意义▲

林士云 曾志羽 马国添 吴 海 夏炳辉 阮 翔

(广西医科大学第一附属医院老年心内科，南宁市 530021，E-mail：447922897@qq.com)

目的 探讨巴马小型猪冠状动脉微栓塞(CME)后心肌组织白细胞介素-1受体相关激酶1(IRAK1)、肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)及AU碱基富集区RNA结合因子1(AUF1)的动态表达情况及其意义。方法 将30只巴马小型猪分为假手术组(n=5)和CME组(n=25)。CME组经微导管于左前降支中远端注入微栓塞球混悬液；假手术组注射等量生理盐水。将CME组均分为5组于建模后3 h、6 h、9 h、12 h、24 h进行观察；假手术组小型猪于6 h后进行观察。光镜下观察各组心肌组织改变，并检测心肌组织IRAK1、TRAF6及AUF1 mRNA表达。结果 建模后6 h，CME组血管内均可见微栓塞球，周围出现微梗死灶。建模后6 h，与假手术组比较，CME组心肌组织IRAK1、TRAF6及AUF1 mRNA的表达水平均显著增加(P<0.05)。CME组心肌组织IRAK1、TRAF6及AUF1 mRNA的表达水平都在建模后3 h和6 h升高，9 h达高峰，12 h和24 h下降；与3 h和24 h比较，CME组9 h心肌组织IRAK1、TRAF6及AUF1 mRNA的表达水平均显著增加(P<0.05)。结论 IRAK1、TRAF6及AUF1 mRNA高表达于CME后心肌组织，并呈现出明显的时间变化规律。

冠状动脉微栓塞；白细胞介素-1受体相关激酶1；肿瘤坏死因子受体相关因子6；AU碱基富集区RNA结合因子1；巴马小型猪

在急性冠状动脉综合征和经皮冠状动脉介入治疗过程中，粥样硬化斑块破裂产生的微小栓子可导致冠状动脉微栓塞(coronary microembolization，CME)。CME可引起心肌微循环障碍，导致“慢复流”或“无复流”现象发生，严重影响患者的心功能及远期预后；研究表明CME致心功能损伤主要与心肌炎症有关[1-2]。白细胞介素-1受体相关激酶1(interleukin-1 receptor-associated kinase 1，IRAK1)及肿瘤坏死因子受体相关因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF6)是炎症信号通路中关键信号调节分子，广泛参与炎症和免疫应答[3-4]。AU碱基富集区RNA结合因子1(AU-rich element RNA-binding factor 1，AUF1)通过与mRNA 3′端未翻译区上AU碱基富集区结合，调节mRNA降解，参与炎症调控，并在心血管疾病中发挥重要作用[5]。因此，我们推测IRAK1、TRAF6及AUF1可能参与了CME后心肌炎症，但有关其在CME后心肌组织中的表达情况和作用的研究甚少。为此，本研究通过探讨CME后心肌组织IRAK1、TRAF6及AUF1表达的动态变化规律，旨在为CME的临床防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器 微栓塞球(美国Biosphere Medical公司，规格40～120 μm)；TriPure Isolation Reagent试剂盒(美国Roche公司，批号11667165001)；All-in-OneTMFirst-Strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒(美国GeneCopoeia公司，批号AORT-0050)、All-in-OneTMqPCR Mix检测试剂盒(美国GeneCopoeia公司，批号AOPR-0200)、All-in-OneTMqPCR Primer(美国GeneCopoeia公司)；iQ5TMReal-Time PCR Detection System(美国Bio-Rad公司)；NanoDrop®8000分光光度计(美国Thermo公司)；其他均为常规仪器和试剂。

1.2 实验动物、分组及模型建立 健康广西巴马小型猪30只，雌雄不拘，体重25～30 kg，45～55周龄，由广西大学动物科学技术学院提供(许可证号：SCXK桂2007-0003)。小型猪饲养于通风清洁环境，规律照明，实验过程遵守《医学实验动物管理实施细则》及动物实验伦理学原则。利用随机数表法随机分为CME组25只和假手术组5只。猪CME模型的建立参考马国添等[6]报告的造模方法，具体步骤如下：小型猪经氯胺酮和阿托品肌注诱导麻醉后，穿刺耳大静脉给予戊巴比妥钠静脉滴注维持麻醉，如有躁动不安则静脉注射地西泮。分离暴露一侧股动脉，用21号Cordis桡动脉穿刺针进行穿刺，成功后置入6F桡动脉鞘。经鞘注入肝素200 U/kg达肝素化，此后以100 U/(kg·h)维持。行冠状动脉造影，随之经指引导管送入微导管至左前降支分出第一对角支后的远端，将10万计数微栓塞球(微栓塞球混悬于20 ml生理盐水中)经微导管注入左前降支，20 min注射完毕。同样操作过程，假手术组给予注射等量生理盐水。将CME组小型猪随机分为5组，每组5只，分别于建模后3 h、6 h、9 h、12 h、24 h进行观察；假手术组在6 h进行观察。

1.3 组织取材及样品处理 经耳缘静脉注射10 ml 10%氯化钾注射液处死实验动物，开胸取出心脏，迅速取心尖处部分心肌放入焦碳酸二乙酯处理过的冻存管，投入液氮罐中，然后转移至-80℃冰箱保存，检测IRAK1、TRAF6及AUF1 mRNA表达。另取心尖处部分心肌，4%多聚甲醛固定24 h后，苏木素-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色，光镜下观察心肌组织改变。

1.4 IRAK1、TRAF6及AUF1 mRNA表达检测 取约100 mg样品至冷冻研钵中，加入液氮研磨至粉末状，按照Trizol 操作说明提取心尖心肌组织的总RNA，并用分光光度计测量其浓度和纯度，采用cDNA 反转录试剂盒逆转录。采用SYBRGreenⅠ荧光标记法检测PCR 产物，IRAK1 引物：上游：5′-TGATGCCCAAACTGGGAGAC-3′，下游：5′-GTCTTGACGTAGTCCTCGGG-3′；TRAF6 引物：上游：5′- CCAGAGACCCACAATCCCAC-3′，下游：5′-TGGAGACCTCACAGCGTACT-3′；AUF1 引物：上游：5′-GCCCAGGTTACGGTGGTTAT-3′，下游：5′-CCTCGCCTGGATACTTTCCC-3′；甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)引物：上游：5′-GCTACACTGAGGACCAGGTTG-3′，下游：5′-TACCAGGAAATGAGCTTGACG-3′。按试剂盒说明设置反应体系及参数，每个样本均进行复孔检测，同时每次反应均设置阴性孔，PCR产物均经过测序检测。结果采用2-ΔΔCt法比较。

1.5 统计学分析 采用SPSS 16.0软件进行统计分析。计量资料以(x±s)表示，两组间比较采用成组t检验，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 CME心肌组织病理学观察 HE染色结果显示，假手术组6 h未见明显心肌微梗死灶；于建模后3 h、6 h、9 h、12 h、24 h CME组血管内均可见微栓塞球，周围出现微梗死灶，周边心肌水肿、变性，并有炎性细胞浸润和红细胞渗出。见图1、图2。

图1 微栓塞6 h 假手术组心肌组织病理改变(HE染色，×100)

图2 微栓塞6 h CME组心肌组织病理改变(HE染色，×100)

注：箭头示微栓塞球

2.2 CME建模后6 h IRAK1、TRAF6及AUF1 mRNA表达水平的变化 建模后6 h，与假手术组比较，CME组心肌组织IRAK1、TRAF6及AUF1 mRNA的表达水平均显著增加(P<0.05)。见表1。

表1 CME建模后6 h IRAK1、TRAF6及AUF1 mRNA表达水平的变化(x±s)

2.3 CME组建模后不同时点心肌组织IRAK1、TRAF6及AUF1表达水平的动态变化 CME组心肌组织IRAK1、TRAF6及AUF1 mRNA的表达水平在建模后3 h和6 h升高，9 h达高峰，12 h和24 h下降。与建模后3 h和24 h比较，CME组9 h心肌组织IRAK1、TRAF6及AUF1 mRNA的表达水平均显著增高(P<0.05)；CME组24 h心肌组织IRAK1、TRAF6及AUF1 mRNA的表达水平与建模后3 h比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。

注：与建模后3 h比较，*P<0.05；与建模后24 h比较，#P<0.05。

3 讨 论

CME是急性冠状动脉综合征及经皮冠状动脉介入治疗过程中的常见并发症，目前无论是药物还是直接机械血栓清除术等措施均不能显著改善患者近期或远期预后。关于CME 致心功能损伤的机制，近年研究表明心肌炎症反应在CME致心功能损伤中发挥重要作用。CME发生后，心肌细胞因微循环障碍导致坏死、继发炎症反应以及肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)等促炎症因子分泌明显增加，并与心功能损伤密切相关[1-2]。此外有研究证实通过抑制核因子-кB活化减弱CME致心肌炎症可显著改善心功能[7]。有研究发现，假手术组各时间点心肌炎症相关指标和心功能改变差异无统计学差异[8]，因此，本研究假手术组仅选取6 h作为观察点。本研究中，心肌组织病理学观察发现假手术组未见明显心肌微梗死灶，而CME组出现微梗死灶和炎症反应，提示本研究模型制备成功。

IRAK1和TRAF6是炎症信号通路中关键信号调节分子，可诱导TNF-α、IL-1β等促炎症因子产生[3-4]；有研究发现，在急性心肌梗死大鼠的心肌组织中TRAF6表达明显增高[9]。AUF1作为首个被纯化及克隆的AU碱基富集区结合蛋白，可通过与mRNA 3′端未翻译区上ARE的结合从而调控目标mRNA降解及蛋白质生成，近年来研究发现，心肌肥大和心功能衰竭时AUF1表达明显增高[5]；此外，动物实验表明AUF1基因敲除小鼠由于调节目标mRNA降解能力受损，使TNF-α和IL-1β等促炎症因子过度表达，导致严重感染性休克[10]。本研究发现，CME后6 h心肌组织IRAK1、TRAF6 和AUF1表达水平较假手术组明显升高(P<0.05)，提示IRAK1、TRAF6 和AUF1可能参与CME后心肌炎症反应。因此我们推测CME后心肌组织IRAK1和TRAF6表达增多，导致TNF-α、IL-1β等促炎症因子分泌增加，而AUF1反应性升高，通过与TNF-α、IL-1β等促炎症因子mRNA 3′端未翻译区域上的AU碱基富集区结合，加速其mRNA降解，从而抑制促炎因子表达，减轻心肌炎症。

研究表明，CME后心肌组织TNF-α表达水平呈现动态的变化，并与心功能的变化呈明显的负相关[8]。本研究结果显示，CME组建模后9 h心肌组织IRAK1、TRAF6及AUF1表达水平较建模后3 h与24 h明显升高，而3 h与24 h表达水平无明显差异，CME后心肌组织IRAK1、TRAF6 和AUF1表达呈现出的这一时间变化规律与TNF-α表达变化规律基本吻合，说明CME后心肌炎症呈动态改变，可能通过IRAK1、TRAF6及AUF1调控TNF-α等促炎症因子表达实现。这提示CME后心肌组织3 h出现炎症并随时间逐渐加重，9 h炎症达到高峰，12 h炎症消退，24 h后炎症反应减轻至3 h水平。

综上所述，IRAK1、TRAF6和AUF1在CME后心肌组织中高表达，并呈现出明显的时间变化规律。该规律揭示了CME后炎症反应的动态演变过程，为临床干预CME后心肌炎症的时间选择提供了参考。

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Expressions and significance of interleukin-1 receptor-associated kinase 1,tumor necrosis factor receptor-associated factor 6 and AU-rich element RNA-binding factor 1 mRNA in Bama miniature pig with coronary microembolization

LINShi-yun,ZENGZhi-yu,MAGuo-tian,WUHai,XIABing-hui,RUANXiang

(DepartmentofGeriatricCardiology,theFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

Objective To explore the dynamic changes and significance of interleukin-1 receptor-associated kinase 1(IRAK1),tumor necrosis factor receptor-associated factor 6(TRAF6) and AU-rich element RNA-binding factor 1(AUF1) expressions in the Bama miniature pig with coronary microembolization(CME).Methods A total of 30 Bama miniature pigs were divided into sham group(n=5) and CME group(n=25).CME group was induced by injection of microspheres into left anterior descending artery through micro-catheter,and the sham group was injected with the same volume of normal saline.At 3,6,9,12 and 24 hours after modeling,CME group was equally divided into 5 subgroups for observation.The miniature pigs in the sham group were observed at 6 hours after modeling.The changes of myocardial tissues in each group were observed using optical microscope,and the expressions of myocardial IRAK1 mRNA,TRAF6 mRNA and AUF1 mRNA were determined in each group.Results At 6 hours after modeling,the endovascular microspheres and micro-infarction around were found in CME group.Compared with the sham group,the expression levels of IRAK1 mRNA,TRAF6 mRNA and AUF1 mRNA increased significantly in CME group at 6 hours after modeling(P<0.05).In CME group,the expression levels of IRAK1 mRNA,TRAF6 mRNA and AUF1 mRNA increased significantly at 3 and 6 hours after modeling,reached the maximum level at 9 hours after modeling,and then decreased at 12 and 24 hours after modeling.In CME group,the expression levels of myocardial IRAK1 mRNA,TRAF6 mRNA and AUF1 mRNA at 9 hours after modeling significantly increased compared with the expression levels at 3 and 24 hours after modeling(P<0.05).Conclusion IRAK1 mRNA,TRAF6 mRNA and AUF1 mRNA are overexpressed in the myocardium after CME,and appear obvious time variation.

Coronary microembolization,Interleukin-1 receptor-associated kinase 1,Tumor necrosis factor receptor-associated factor 6,AU-rich element RNA-binding factor 1,Bama miniature pig

广西医疗卫生适宜技术研究与开发课题(S201303-01)；广西医科大学青年科学基金(GXMUYSF201213)

林士云(1985～)，男，在读硕士研究生，研究方向：心血管疾病。

马国添(1975～)，男，博士，主任医师，研究方向：心血管疾病，E-mail：drguotianma@163.com。

R 543.31

A

0253-4304(2016)05-0619-05

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.05.05

2016-01-07

2016-03-15)