血清循环DNA微卫星位点杂合性缺失对宫颈癌与卵巢癌诊断的应用价值研究

朱丽英 刘鑫 袁静 刘丽荣

(贵阳医学院医学检验学院,贵州 贵阳 550004)

血清循环DNA微卫星位点杂合性缺失对宫颈癌与卵巢癌诊断的应用价值研究

朱丽英 刘鑫 袁静 刘丽荣△

(贵阳医学院医学检验学院,贵州 贵阳 550004)

目的 探讨血清循环DNA微卫星位点杂合性缺失(LOH)对宫颈癌与卵巢癌的诊断应用价值。方法 选取6个微卫星位点，采用血液基因组DNA提取试剂盒抽提各组血清标本循环DNA 、PCR、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及硝酸银染色对63例宫颈癌和33例卵巢癌(病例组)、63例子宫肌瘤(良性对照组)、63名健康成年女性血清标本(健康对照组)进行检测。结果 宫颈癌在D3S1038、D3S1300、D3S1228位点LOH频率分别为53.4%、60.3%、57.1%；卵巢癌在D17S579、D17S855、D17S786、D3S1038位点的LOH频率分别为：45.5%、42.4%、27.3%、51.3%；所有位点的病例组与健康对照组的LOH差异有统计学意义(P<0.05)；宫颈癌D3S1228位点与良性对照组的LOH差异有统计学意义(P<0.05)；卵巢癌D17S579与D17S855位点与良性对照组的LOH差异有统计学意义(P<0.05)。结论 宫颈癌D3S1228位点及卵巢癌D17S579、D17S855位点具有较高的LOH，为进一步研究血清循环DNA作为宫颈癌与卵巢癌的遗传学辅助诊断指标提供了一定的实验基础。

循环DNA； 宫颈癌； 卵巢癌； 杂合性缺失

许多肿瘤患者循环DNA(circulatingcell-DNA，c-DNA)与正常人相比有很大差异，尤其是循环DNA检测避免了当前分子诊断需要采集癌组织作为标本来源的困难，是一种有潜力的肿瘤标志物。研究[1]发现，一些肿瘤患者血清中c-DNA具有与肿瘤组织中DNA相一致的分子遗传学改变，如杂合性缺失(loss of heterozygosity，LOH) 。因此，寻找并确定宫颈癌及卵巢癌基因的LOH高发位点，对其辅助诊断具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本来源 收集自2013年7月至2015年2月在贵阳医学院附属医院和贵州省肿瘤医院经临床病理检查确诊为宫颈癌患者63例、卵巢癌患者33例、子宫肌瘤患者和健康成年女性各63例血清标本，分别于-80 ℃保存。

1.1.2 主要试剂 血液基因组DNA提取试剂盒购自北京天根生物有限公司；引物合成由上海生工生物工程公司合成；Mix Taq DNA聚合酶购自大连TaKaRa公司；丙烯酰胺、N,N-甲叉双丙烯酰胺购自上海华美公司；乙二胺四乙酸(EDTA)购自美国Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 血清循环DNA的提取 取600 μL血清标本，按DNA提取试剂盒的说明操作。分别取子宫肌瘤患者血清标本作为良性对照组，健康成年女性血清标本作为从作健康对照组。

1.2.2 PCR 本研究所用微卫星有D3S1038、D3S1300、D3S1228、D17S579、D17S855、D17S786，其PCR 产物大小( bp ) 分别为115 bp、49 bp、89 bp、96 bp、104 bp、135 bp。所有位点的标志参数均查自Gene Bank。PCR反应体系25 μL:含 Mix Taq聚合酶12.5 μL,各种引物5 μL、模版DNA 4.0 μL、无菌双蒸水3.5 μL 。95℃预变性10 min；95 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃30 s,共35个循环；72 ℃7 min，4℃保存。

1.2.3 电泳 取PCR产物5 μL，加4 μL Loading buffer充分混匀，室温下8%变性聚丙烯酰胺凝胶溶液电泳，加样后120 V稳压电泳约1 h。

1.2.4 银染色 胶板浸入10% 乙醇45 min，0.2%AgNO3，35 min，3%Na2CO35 min，5%冰乙酸终止显色。每一步反应后都用双蒸水清洗。

1.2.5 结果判定 LOH判定标准：参照文献[2]的判定, 与健康对照组多肽性条带相对照，基因条带消失或密度减少50% 以上为LO H。

1.3 统计学方法 实验结果采用SPSS17.0统计软件处理，采用χ2检验。

2 结 果

宫颈癌在病例组D3S1038、D3S1300、D3S1228位点的LOH发生率分别为53.4%、60.3%、57.1%；子宫肌瘤在良性对照组D3S1038、D3S1300、D3S1228位点的LOH发生率分别为38.1%、46.0%、34.9%；宫颈癌3个位点与健康对照组的LOH差异有统计学意义(P<0.05)；子宫肌瘤D3S1300位点与健康对照组的LOH差异有统计学意义(P<0.05)；宫颈癌D3S1228位点与良性对照组的LOH差异有统计学意义(P<0.05)。

卵巢癌在D17S579、D17S855、D17S786、D3S1038位点的LOH率分别为：45.5%、42.4%、27.3%、51.3%。子宫肌瘤在D17S579、D17S855、D17S786、D3S1038位点的LOH率分别为：22.2%、17.5%、12.7%、38.1%。卵巢癌4个位点的病例组与健康对照组的LOH差异有统计学意义(P<0.05)；子宫肌瘤D17S579、D3S1038位点与健康对照组的LOH差异有统计学意义(P<0.05)卵巢癌D17S579和D17S855位点与良性对照组的LOH差异有统计学意义(P<0.05)，见表1、图1。

表1 卵巢癌各位点发生LOH频率[n(%)]

注：与健康对照组比较，*P<0.05，#P<0.05；与良性对照组比较，△P<0.05。

3 讨 论

c-DNA是一种存在于动、植物和人的体液中的无细胞状态的胞外DNA。研究[3]表明，外周血c-DNA一部分以游离形式存在于血清中，体细胞抑癌基因的失活是导致癌变的一个主要因素，常表现为LOH。染色体LOH是指肿瘤基因组中特定染色体上某种DNA多态标记(如微卫星标记)的等位基因片段由正常组织基因组的两种变成一种，即等位基因型由杂合子变成纯合子。造成LOH的原因可能是多位点染色体事件(如缺失、有丝分裂重组及不分离)、基因转变和点突变的结果，从而导致抑癌基因附近的侧翼标记丢失，结果抑癌基因附近区域与发生第一次突变的等位基因相连的序列，成为纯合性或半合性。

D3S1300和D3S1228两个位点均位于3p14基因内部，D3S1038位点定位于3p25。对于染色体3p对宫颈癌早期诊断是否有预测作用，存在一定的争议[4]。本研究的检测结果表明，宫颈癌D3S1228位点LOH发生率明显高于子宫肌瘤组(P<0.05)，因此，我们认为3p区域LOH对宫颈癌的诊断有重要的预测作用。张国玲[5]等发现50例原发性上皮性良恶性卵巢肿瘤(40例癌组织10例非癌组织)3p25 处LOH频率为40.0%。在本次研究中， D3S1038位点发生LOH的频率为51.5%。

D17S579位点和D17S855位点位于17q21，均与BRCA1基因连锁，其中D17S855位点位于BRCA1基因内部，而D17S579位点位于BRCA1基因的外侧。D17S786与p53基因连锁。刘争等[6]发现在乳腺型导管增生组中，D17S855、D17S579位点LOH频率分别为10%、16.7%，在浸润性导管癌中LOH频率均>25%。本研究结果显示，卵巢癌在D17S579、D17S855位点LOH发生率明显高于子宫肌瘤组(P<0.05)，因此，我们推测BRCA1基因相关的D17S855位点、D17S579位点的LOH对卵巢癌的诊断有重要的预测作用。刘铭等[7]采用PCR荧光测序仪凝胶电泳检测34例食管癌患者手术切除的鳞状细胞癌组织在D17S786等16个MS位点的LOH状况，鳞状细胞癌在D17S786位点LOH频率为69.5%。本研究的检测结果表明，卵巢癌D17S786位点发生LOH频率>25%，由此我们推测D17S786位点是卵巢癌发展中发挥着重要的转录调节作用的肿瘤抑制因子，它可能是一个卵巢癌高发的基因标志物。但能否最终应用于临床上作为诊断卵巢癌的特异性基因标志物还需进一步作大量深入的研究及随访调查证实。

(本文图1见封三)

[1] 薛建祥，龚波，俞菁，等．乳腺癌患者血清游离DNA的定量检测[J]．肿瘤，2011，31(12)：1099-1102．

[2] 成凡，楚雍烈，贺大林，等．尿脱落细胞6号染色体长臂的微卫星改变诊断膀胱肿瘤[J]．第四军医大学学报，2003，24(8)：693-695．

[3] 赵心亮，田广明，田亚平．人体循环游离DNA应用的研究进展[J]．临床检验杂志，2013，31(2)：109-114．

[4] 王靖，张煦，徐星榕，等．宫颈癌染色体杂合性缺失和微卫星不稳定性分析[J]．西北国防医学杂志,2009,3(30):174．

[5] 张国玲，陈鸣之，杨慧娟，等．上皮性卵巢肿瘤中 3P14 、3P25 杂合性丢失[J].中国癌症杂志，2011,11(5)：416-417．

[6] 刘争，赵华，罗志永，等．乳腺癌与癌前病变微卫星DNA杂合性缺失研究[J]．中国实验诊断学，2011，15(4)：592-595．

[7] 刘铭，曾会昌，张晓莉．食管鳞状细胞癌及癌前病变组织中多个染色体区域微卫星杂合性缺失的研究[J]．中华外科杂志，2008，46(17)：1337-1339．

Diagnostic value of serum circulating DNA microsatellite LOH for cervical cancer and ovarian cancer

ZhuLiying,LiuXin,YuanJing,LiuLirong.

DepartmentofClinicalLaboratoryScience,GuiyangMedicalCollege,Guiyang550004,China.

Objective To explore the efficiency of serum circulating DNA microsatellite LOH in the diagnosis of cervical cancer and ovarian cancer. Methods Six sites of microsatellite were selected. Serum circulating DNA (c-DNA) was extracted with blood genomic DNA extraction kit. LOH were detected with polymerase chain reaction (PCR) and denaturing polyacry1amide gelelectrophoresis in 63 cases of varian cancer, 33 cases of ovarian cancer (pathological group), 63 cases of hysteromyoma (benign group) and 63 healthy adult women serum (healthy control group). Results The rates of LOH on cervical cancer at D3S1038, D3S1300 and D3S1228 were 53.4%, 60.3% and 57.1% respectively. The rates of LOH on ovarian cancer at D17S579, D17S855 , D17S786 and D3S1038 were 45.5%, 42.4%, 27.3% and 51.3% respectively. Significant difference was observed in LOH between pathological group and healthy control group at all the sites (P<0.05). There was significant difference in LOH rates between benign group and cervical cancer at D3S1228, and between benign group and ovarian cancer at D17S579 and D17S855 (P<0.05). Conclusion LOH on D3S1228 are common in cervical cancer ,and LOH on D17S579 and D17S855 are common in ovarian cancer. This study could provide the experimental basis for further study on serum c-DNA as auxiliary diagnostic indicators of cervical cancer and ovarian cancer.

Circulating DNA; Cervical cancer; Ovarian cancer; Loss of heterozyosity

贵州省科学技术基金[黔科合J字(2011)2233号]

R737.31；R737.33

A

1000-744X(2016)01-0011-02

2015-10-21)

△通信作者，E-mail:249018257@qq.com