内皮祖细胞对药物洗脱支架置入术后再狭窄及再内皮化影响的研究进展

孙文博　王　贺　司春婴　解金红　陈玉善　柴爽爽　关怀敏.河南中医药大学研究生处，河南郑州450000；.河南中医药大学第一附属医：心脏中心，河南郑州450000

内皮祖细胞对药物洗脱支架置入术后再狭窄及再内皮化影响的研究进展

孙文博1王贺2司春婴2解金红2陈玉善2柴爽爽2关怀敏2
1.河南中医药大学研究生处，河南郑州450000；2.河南中医药大学第一附属医：心脏中心，河南郑州450000

经皮冠状动脉介入治疗是目前治疗冠心病的主要手段，但支架内再狭窄严重影响了其长期疗效。研究发现，支架内再狭窄的发生主要与内皮损伤、再内皮化延迟有关。快速完全的再内皮化是预防支架内再狭窄的重要方法。而内皮祖细胞在受损内皮再修复的过程中起重要作用，有研究发现通过促进内皮祖细胞动员、移植内皮祖细胞或者捕获循环中的内皮祖细胞等方式，促进其增殖、迁移、分化及归巢，可以加速受损血管的再内皮化，这为有效防止支架内再狭窄提供了一个很好的研究方向。

内皮祖细胞；支架内再狭窄；再内皮化

［Avsteact］Percutaneous coronary intervention is themajormeans in the treatment of coronary heart disease，but instent restenosis seriously affect its long-term efficacy.Studies have found that the occurrence of in-stent restenosis is mainly associated with endothelial injury and the delay of re-endothelialization.Fast and complete re-endothelial is an importantway to prevent stent re-stenosis.While，endothelial progenitor cells play an important role in the process of endothelial repair.A study has provided a good research direction to effectively prevent the in-stent restenosis.It is confirmed that promoting endothelial progenitor cellsmobilization，transplantation of endothelial progenitor cells or capture circulating endothelial progenitor cells，and promoting its proliferation，migration，differentiation and homing，can accelerate re-endothelialization of damaged blood vessels.

［Key woeds］Endothelial progenitor cells；In-stent restenosis；Re-endothelialization

经皮冠状动脉介入治疗（percutaneous coronary intervention，PCI）是目前治疗冠心病的主要手段，显著地改善了冠心病患者的临床预后。但是虽然冠状动脉内支架不断改进，术后抗血小板药物应用也越来越广泛，但是PCI的术后并发症——支架内再狭窄的发生率依然高达12%［1］，是影响支架远期疗效的主要因素。大量研究表明支架内再狭窄的原因主要是内皮损伤，再内皮化延迟，导致炎性反应，平滑肌细胞及细胞外基质过度增殖，形成新的内膜。内皮祖细胞是血管内皮细胞的前体细胞，血管损伤后定向迁移至受损血管处，增殖、分化为血管内皮细胞，修复受损血管内皮，在血管损伤反应中起到重要作用［2］，为有效防止支架内再狭窄提供了一个很好的研究方向。因此，通过修复内皮细胞，促进支架后再内皮化是预防和解决支架内再狭窄最有效的方法［3］。

1　PCI术后血管损伤及支架内再狭窄

支架内再狭窄（in-stent restenosis，ISR）是指冠状动脉支架置入术后8～12个月冠脉造影显示支架内或边缘5 mm内的血管狭窄大于50%，伴或不伴有相关临床症状或心血管事件［4］。

正常的血管内皮细胞能够分泌多种活性物质来维持血管生理功能稳态。而行经皮冠状动脉腔内成形术（percutaneous transluminal coronary angioplasty，PTCA）或者金属支架植入后，引发内皮损伤，内皮细胞的单层完整性被破坏，内皮下胶原纤维暴露，启动外源性与内源性凝血系统，激活血小板，引起血小板黏附、聚集继而形成富含血小板的血栓，从而引起再狭窄的发生。此外血管损伤也会激发炎性反应，引起淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞等炎症细胞聚集并释放炎症因子［如白细胞介素（IL）-6、IL-8、肿瘤坏死因子（TNF）-α等］和细胞因子（如内皮素、C反应蛋白等）等引起平滑肌细胞增殖、迁移及细胞外基质的沉积，导致再狭窄的进一步加重［5-10］。Zhang等［11］的研究也提示了支架内再狭窄的发生与炎性反应密不可分。因此，内皮受损是PCI术后再狭窄发生的始动因素。虽然近年来药物洗脱支架的使用明显减少了再狭窄的发生［12］，但这一问题依然存在［13］，并成为影响PCI术后长期疗效的主要因素，因为药物洗脱支架携带的抗增殖药在抑制新生内膜增殖的同时也抑制了内皮细胞的增殖，导致支架内皮覆盖不全，进而引起再狭窄和支架内晚期血栓发生［14］。因此，改善、修复内皮的结构和功能，加速受损血管的再内皮化是解决支架内再狭窄的关键［15］。

2　内皮祖细胞的生物学特性

1997年Asahara等［16］采用免疫磁珠吸附法发现外周血中存在可以分化为血管内皮细胞的造血干细胞，并表达CD34+，他将这种干细胞命名为内皮祖细胞。EPC主要存在于骨髓中，成人的脐带血中也存在，外周血中也存在极少量的EPC。体外培养EPCs 2～3 d开始贴壁，6～7 d的典型形态特征是呈“集落”样生长，以集落为中心放射状向外生长，形成多个细胞团。集落中央为圆形细胞群，周边是梭形细胞，逐渐形成“铺路石”样结构。培养2周后，大部分内皮祖细胞分化呈多角形，细胞集落相互连接，呈“铺路石”样。内皮祖细胞有早期、晚期之分。早期EPC主要以分泌功能为主，分泌细胞因子及相关抗原，晚期内皮祖细胞主要向内皮细胞分化，参与内皮修复［17］。

至今还没有研究发现识别EPCs的特异性标志，所以一般细胞鉴定是通过检测CD34、血管内皮细胞生长因子受体-2（VEGFR-2，也称KDR、Flk-1）、CD133等。其中CD34被广泛用于骨髓内皮祖细胞的鉴定，然而也有研究显示CD34-细胞也可以分化为内皮细胞［18］，所以CD34可能不是最合适的EPC表面抗体。但是目前大多数学者仍认为CD133+、CD34+、VEGFR-2+即为EPC［19］。研究发现，骨髓中的EPC为CD133+、CD34+、VEGFR-2+细胞，而外周血中的EPC则失去CD133，表达出内皮细胞系的标志如VE-钙黏蛋白+、内皮型一氧化氮合成酶（endohelial nitric oxide synthase，eNOS）和CD31等。EPC的不同表面标志反映了骨髓内皮祖细胞向内皮细胞分化的不同发展阶段。另一种鉴定方法是双荧光染色法。EPC体外培养14～21 d行乙酰化低密度脂蛋白（DIL-AC-LDL）和FITC标记的荆豆凝集素Ⅰ（FITC-UEA-Ⅰ）双荧光染色。在激光共聚焦显微镜下FITC-UEA-Ⅰ阳性细胞显绿色，DIL-AC-LDL阳性细胞显红色，显示黄色的双荧光阳性细胞即为正在分化的内皮祖细胞［20］。

内皮祖细胞主要具有增殖、分化、定向迁移、黏附功能。血管内皮损伤后，外周血中的EPC定向迁移至受损处，黏附聚集并分化为血管内皮细胞，骨髓中的EPCs进入外周血，黏附至血管损伤处，增殖、分化为内皮细胞，参与内皮修复。EPCs还具有分泌细胞因子及生长因子的能力，如IL-8、表皮生长因子（EGF）等，然后作用于自身及邻近内皮细胞和组织中的祖细胞，从而发挥内皮样作用［21］，加速血管再内皮化进程。另外EPCs除了能在内皮生长因子的刺激下分化为成熟血管内皮细胞，也可向血管平滑肌细胞（VSMC）分化［22］。

因此，EPC可以定向迁移黏附于支架处，加速血管再内皮化进程，抑制新生内膜的增生及支架内血栓形成，预防支架内再狭窄。

3　血管损伤后EPCs的作用

目前认为EPCs对促进内皮修复有着巨大作用。成人外周血中的内皮祖细胞的数量非常少，即使在脐带血中含量也不超过1%。冠心病PCI支架植入造成的内皮损伤可动员骨髓EPCs进入外周血并增殖分化为有功能的内皮细胞，趋化到损伤血管壁参与损伤血管的再内皮化［23］。

Wu等［24］将带标记的EPC注入球囊损伤颈动脉内皮后的大鼠体内，结果在新生内膜中发现了荧光标记的EPC。这表明移植EPC可以促进损伤血管再内皮化形成完整的内膜，而且实验组的新生内膜面积及内膜中膜面积比明显低于对照组。由此可见，移植的EPC对于快速修复受损内膜、减少新生内膜起到了重要作用。由此可以推断EPC移植可以应用于PCI术后，减少PCI术后并发症的发生，改善预后，减少心血管不良事件的发生。

目前，对PCI术后EPC促进内皮修复作用机制的研究主要通过内皮细胞集落形成单位（endothelial cell colony-forming unit，EC-CFUs）来反映［25］。EC-CFUs表现类似内皮细胞的特征，不仅能够结合凝集素，还能摄取低密度脂蛋白，所以一般认为EC-CFUs源自骨髓源性的EPC。研究发现：在54例冠状动脉造影中，行PCI介入手术的患者EC-CFUs水平明显升高，而单纯造影的患者EC-CFUs水平无明显变化［26］，这可能提示血管损伤会促进骨髓EPC的迁移、增殖以促进受损血管的内皮功能恢复。

4　内皮祖细胞减少再狭窄的治疗策略

PTCA或金属支架植入，引发内皮损伤，引发炎性反应；DES由于抑制了内皮细胞的增生，导致了再内皮化的延迟，从而引发再狭窄的发生。因此，通过移植内皮祖细胞或者捕获循环中的内皮祖细胞，促进其增殖、迁移及分化，从而使受损血管的内皮在短时间内愈合，就可弥补PCI的不足，减少PCI术后再狭窄的发生。

4.1内皮祖细胞捕获支架

内皮祖细胞捕获支架是根据抗原抗体结合的原理，在支架表面包被CD34+抗体，支架植入血管后，循环中的EPC经过抗体包被的支架时，就会与支架上的CD34+抗体结合，随后在支架表面分化成为成熟内皮细胞，形成完整的内皮细胞层，从而防止支架内再狭窄。这一新型支架目的是降低支架内再狭窄及血栓形成，降低PCI术后并发症的发生，同时也可以避免长时间地使用抗血小板药物治疗带来的副作用。

2002年，Kipshidze等［27］将包被有CD34+抗体的支架植入猪冠状动脉内48 h后，包被CD34+抗体的支架表面完全覆盖EPCs，并且在28 d时形成的新生内膜面积明显高于普通支架，这证明了EPC捕获支架在促进再内皮化的有效性。Aoki等［28］于2005年第1次将包被CD34抗体的支架植入患者体内，9个月后发现在参加实验的16例患者中只有1例患者发生心脑血管事件，并且经皮冠状动脉内超声显示支架再狭窄面积仅占支架的（27.2±21.6）%，这证明临床应用内皮祖细胞捕获支架是安全有效的。

4.2内皮祖细胞细胞移植的治疗

Cheng等［29］证实EPCs移植通过PI3K-AKT通路增加鼠心肌梗死模型梗死部位的微血管生成，提高左心射血分数，改善心肌梗死预后。Wu等［24］将带标记的EPC注入球囊损伤颈动脉内皮后的大鼠体内，结果在新生内膜中发现了荧光标记的EPC。且实验组的新生内膜面积及内膜中膜面积比明显低于对照组。由此可见，EPC移植可以快速修复受损内膜，减少新生内膜，减少PCI术后并发症的发生，减少心血管不良事件的发生。

但是，成人外周血中的内皮祖细胞的数量非常少，即使在脐带血中含量也不超过1%。研究发现，循环中内皮祖细胞少的患者更容易发生支架内再狭窄，而且发生支架内再狭窄的患者的内皮祖细胞黏附、增殖、分化能力更低，这对于药物促进内皮祖细胞的动员、增殖、迁移和分化有很大的困难，而且对内皮祖细胞捕获支架的效果也会有一定的影响。而目前，内皮祖细胞体外培养的技术日渐成熟，体外扩增培养内皮祖细胞大大增加内皮祖细胞的数量而且提高内皮祖细胞的纯度，促进其分化，然后回输人体，这样就可以大大增加循环中的内皮祖细胞，进而加速再内皮化，预防PCI术后再狭窄的发生［30］。

5　结语

药物洗脱支架的问世，给PCI的未来带来了新的希望。但是如何实现PCI术后受损处血管的快速再内皮化，避免支架内再狭窄及晚期支架内血栓的形成等并发症的发生，是PCI目前面临的最重要问题。内皮祖细胞可以定向迁移至血管受损处增殖分化，促进血管再内皮化，从而在血管修复中有重要作用，与PCI术后并发症的发生密切相关。然而，目前关于EPC仍然有很多问题没有研究证实［30］。首先，目前仍没有明确内皮祖细胞的精准标志，不仅EPC可以和CD34结合，平滑肌细胞、造血干细胞等都可以与其结合，这就给内皮祖细胞捕获支架的研发带来了很大挑战。其次，EPC的动员、增殖、迁移、分化及归巢，各个环节的机制还没有完全明确。对于内皮祖细胞如何实现再内皮化的机制，仍有很大争议。明确各个环节的机制，对于增加EPC的动员、迁移、黏附、增殖及分化有重要作用。其次，如何合成能与循环中的内皮祖细胞特异结合的物质并运用于临床，还有待于分子技术的进一步发展及大量的临床试验。然而，随着对内皮祖细胞的基础研究进一步深入，临床试验的开展、新型的抗增生药物和新型支架的积极研发等，我们可以相信以EPC为基础的再内皮化治疗未来可以预防PCI术后再狭窄及其一系列并发症的发生。

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Reseaech peogeess on endothelial peogenitoe cells to deug-eluting in-stent eestenosis and ee-endothelialization

SUNWenbo1WANG He2SIChunying2XIE Jinhong2CHEN Yushan2CHAIShuangshuang2GUAN Huaimin2

1.The Graduate School，He'nan University of Chinese Medicine，He'nan Province，Zhengzhou 450000，China；2.Heart Center，the First Affiliated Hospital of He'nan University of Chinese Medicine，He'nan Province，Zhengzhou 450000，China

R541.4

A

1674-4721（2016）08（c）-0054-04

2016-04-25本文编辑：张瑜杰）

国家自然科学基金面上项目（81273949）。

关怀敏（1957.2-），男，医学博士，教授，主任医师，硕士生导师，河南中医药大学第一附属医：心脏中心主任；研究方向：心血管疾病介入治疗的基础与临床研究。