家族性偏瘫性偏头痛CACNA1A基因新突变的研究*

刘祥琴，马勋泰，杜 琼，晏 宁

(1.四川省医学科学院/四川省人民医院检验科，成都 610071;2.西南医科大学附属医院神经内科,四川泸州 646000;3.重庆医科大学附属大学城医院神经内科 401331)

家族性偏瘫性偏头痛CACNA1A基因新突变的研究*

刘祥琴1，马勋泰2，杜 琼1，晏 宁3△

(1.四川省医学科学院/四川省人民医院检验科，成都 610071;2.西南医科大学附属医院神经内科,四川泸州 646000;3.重庆医科大学附属大学城医院神经内科 401331)

目的 探索家族性偏瘫性偏头痛(FHM)与CACNA1A基因突变的关系。方法 通过提取一家系患者和健康人及1 000例健康对照组DNA进行CACNA1A基因测序研究，并进行生物信息学分析。结果 位于CACNA1A基因的8号外显子的新突变位点(c.1168A>G)导致天门冬酰胺替换为天冬氨酸(N390D)。结论 CACNA1A基因突变N390D是新发现的引起FHM的致病突变因素。

先兆偏头痛；基因,CACNA1A;点突变

偏头痛是一种复杂的慢性血管紊乱性疾病，以发作性搏动性头疼为特征，表现为一侧或双侧头部跳痛，伴有恶心、呕吐等植物神经症状，是与心理、社会因素相关的常见心身疾病。家族性偏瘫性偏头痛(familial hemiplegic migraine,FHM)是一种比较少见的带有先兆性的较严重疾病，它常呈单基因常染色体显性遗传。目前，已报道有CACNA1A、ATP1A2、SCN1A 3种基因突变与该病有关。CACNA1A 基因，定位于19p13,编码P/Q 型钙离子通道的1A亚单位,全世界范围内找到了18 个不同的错义突变,其中T666M 与R1347Q 突变是最常见的两种突变[1-4]，由于CACNA1A基因是目前公认的与FHM尤其是与伴小脑功能紊乱症状相关的致病基因[1,5-7]，本研究就在一家系样本中针对该基因进行研究，对CACNA1A基因进行测序，发现的新突变位点。

1 资料与方法

1.1 一般资料 本研究家系来源于重庆医科大学附属大学城医院神经内科收集的一个FHM家系，该家系有3代4人患病，目前有3例患者存活，家系图见图1，所有病患表现有偶发的偏瘫性偏头痛发作，脑脊液淋巴细胞增多，除了先证者女儿(Ⅲ∶1)外，均有眼球震颤等小脑功能紊乱的表现。所有患者脑电图未见有明显异常，先证者的(Ⅱ∶1)还有共济失调的表现，MRI检查提示有小脑萎缩，其余患者未见小脑影像学改变。诊断符合2004年国际头痛协会头痛分类委员会制订的《偏头痛诊断标准》，并排除其他类型头痛、脊髓小脑型共济失调、癫痫等其他神经系统疾病[8]。健康对照组样本采集于2015年1月至2015年6月，在四川省人民医院健康体检中心随机选择健康体检者1 000例，年龄10～85岁，平均(46.5±12.1)岁，排除偏头痛、偏瘫及脊髓小脑型共济失调、癫痫等其他神经系统疾病及这些神经系统家族史。采集标本前实验参与者均签署了知情同意书，本研究通过四川省人民医院医学伦理委员会审查。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA提取 抽取家系中偏头痛患者和健康对照组静脉血5 mL，用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝后，采用酚氯仿抽提乙醇沉淀法提取基因组DNA。

1.2.2 CACNA1A基因测序 CACNA1A基因包含47个外显子，其cDNA包含2 506个氨基酸，参考Ophoff RA的文献结合引物设计软件Primer3(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)，作者设计了43对引物[1]，采用Sanger测序法进行双向测序，测序试剂为BigDye Terminator Cycle 测序试剂盒(Applied Biosystems)，按照试剂说明书操作，使用测序仪为ABI 3130xl，序列分析软件采用Chromas1.62，测序结果通过DNAman 8.0软件进行比对。

1.3 生物信息学分析 通过SIFT HOME(http://sift.jcvi.org/)和NCBI的HomoloGene进行突变的初步生物信息学分析，序列的比对应用DNAman 8.0软件。

2 结 果

2.1 测序结果 在3位偏头痛患者CACNA1A基因测序结果中均发现一新突变，该基因8号外显子第1 168核苷酸A突变为G杂合双峰(c.1168A>G)，在1 000例健康对照组人群及家系中健康成员则未发现此突变，见图2。

图1 FHM家系图

第8号外显子第1 168位核苷酸显示患者A/G杂合双峰(箭头所指)，表示在该位点A突变为G。

图2 CACNA1A基因突变位点DNA序列图

2.2 生物信息学分析结果 该CACNA1A基因新突变导致第390位氨基酸密码子由AAT替换为GAT，编码氨基酸由天冬酰胺突变为天冬氨酸N390D。该突变位置氨基酸在各物种中相当保守，通过9个物种比对未见该位点有变化。该突变经SIFT软件分析预测为“DAMAGE”突变(SIFT Score=0.02分)，见图3。

结果显示该段蛋白及突变点(红色框内)氨基酸序列非常保守，突变可能导致疾病的发生。

图3 9个物种氨基酸序列比对

3 讨 论

本研究在一个偏头痛家系中发现由CACNA1A基因一个错义突变(c.1168A>G，N390D)引起的一系列偏瘫性偏头痛临床表现，包括偶发的偏瘫性偏头痛发作，迟发性的小脑功能紊乱，轻度的脑脊液细胞增多。值得注意的是，虽然患者发生的偏瘫次数不多，但这也符合《偏头痛诊断标准ICHD-Ⅱ》对偏瘫性偏头痛的诊断[8]。

在此家系中，本研究认为CACNA1A基因氨基酸的390位天门冬酰胺错义突变为天门冬氨酸,导致偏瘫性偏头痛，主要有以下证据：(1)CACNA1A基因编码形成一个由4个同源亚基组成的跨膜域这是已知功能的重要通道的电压传感器[6]，CACNA1A基因是目前公认报道的与FHM尤其是伴小脑功能紊乱症状的致病基因[1,5-7]。(2)第390位天门冬酰胺、天门冬氨酸突变在本研究家系中表现出明显的遗传共分离现象；(3)该突变的区域位于CACNA1A基因的相当稳定的区域，从NCBI Gene Bank中查询比对的9种由高级到低级的物种该区域的氨基酸都是一样的，说明该段序列在进化上是相当保守稳定的，该突变势必会导致疾病的发生[1]， 在本突变附近的第388、389位已有错义突变导致共济失调的文献报道[9-10]。(4)该突变区域位于同源结构域Ⅰ和Ⅱ之间，负责与β亚基结合。(5)在1 000个健康人未发现有CACNA1A基因的此种氨基酸突变，故认为此种突变有可能导致FHM的发生。

电压依赖的钙通道调节钙离子进入兴奋的细胞,参与激素或神经递质释放、肌肉收缩和基因表达等各种钙依赖过程。钙通道复合体由α1、β、α2、δ,γ亚基组成，其中起主要作用的是α1亚基，其余亚基主要起调节作用。各种不同类型的钙通道主要是α1亚基不同(包括α1A、α1B、α1C、α1D、α1E和α1S)，CACNA1A基因编码电压门控钙离子通道上的孔道形成蛋白α1A亚基。CACNA1A表达在与偏头痛相关的大脑皮质、三叉神经节及脑干神经核等神经组织。这个基因的突变与FHM和共济失调有关。神经递质的释放、神经元的兴奋都由位于神经元、突触前膜及树突通道钙离子通过电压门控钙离子通道进入突触后膜而调节。

在本研究中，该突变区域位于同源结构域Ⅰ和Ⅱ之间，该区域负责与β亚基结合，推测该突变可能会导致α1A亚基与β亚基结合的调节异常，而引起CACNA1A蛋白这一P/Q型离子流的密度和门控特性的改变，致使钙通道的功能改变，从而导致神经元的过度兴奋及持续去极化，继发皮层扩布性抑制(cortical spreading depression，CSD)的阔值降低，引发偏头痛[11-12]。该家系病患发生的迟发性进展性的小脑综合征也是偏瘫性偏头痛的临床表现之一，据报道约有40%～50%的CACNA1A突变患者有小脑综合征表现[7]。

综上所述，本研究在一个偏头痛家系中发现CACNA1A基因一个新的错义突变(N390D)，该突变可导致FHM，可能还与小脑综合征的发生有关。该研究的发现不仅扩大了偏头痛致病基因突变谱，而且更加肯定了CACNA1A基因突变会导致FHM、小脑功能紊乱，共济失调等神经系统疾病的发生。但该突变导致该疾病的发生机制还有待通过转基因动物的构建进行下一步的研究。

[1]Ophoff RA,Terwindt GM,Vergouwe MN,et al.Familial hemiplegic migraine and episodic ataxia type-2 are caused by mutations in the Ca2+channel gene CACNL1A4[J].Cell,1996，87(3):543-552.

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Study on novel mutation of CACNA1A gene in familial hemiplegic migraine*

LiuXiangqin1,MaXuntai2,DuQiong1,YanNing3△

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,SichuanAcademyofMedicalSciences/SichuanProvincialPeople′sHospital,Chengdu,Sichuan610071,China;2.DepartmentofNeurology,FirstAffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan646000,China;3.DepartmentofNeurology,UniversityTownHospital,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing401331,China)

Objective To investigate the relationship between familial hemiplegic migraine (FHM) with the mutation of CACNA1A gene.Methods Total genomic DNA of a family affected members and 1 000 normal controls was extracted for conducting the CACNA1A gene sequencing research and the bioinformatics analysis.Results The novel mutation site c.1168A>G of exon located in CACNA1A gene led to Asn to be replaced with Asp (N390D).Conclusion The mutation(N390D) of CACNA1A gene is a newly found novel pathogenic mutation lead to familial hemiplegic migraine.

migraine with aura; genes,CACNA1A; point mutation

重庆市自然科学基金项目(cstc2012jjA10093)；四川省人民医院青年基金项目[省医行(2014)94号]。

刘祥琴(1978-)，主管技师，硕士，主要从事分子遗传学研究。△

，E-mail:852188765@qq.com。

��·临床研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.10.016

R277.7

A

1671-8348(2016)10-1348-02

2015-12-08

2016-01-26)