电针复合七氟烷麻醉对断尾大鼠急性应激反应调控的影响*

胡 越,刘 莉,熊威威,谭 毅,黄志华,李爱国,杨 华，蒋奕红△

(1.桂林医学院研究生院,广西桂林 541001；2.湖北省武汉市第三医院麻醉科 430000; 3.桂林医学院附属医院麻醉科,广西桂林 541001;4.桂林医学院附属医院中医科，广西桂林 541001)

电针复合七氟烷麻醉对断尾大鼠急性应激反应调控的影响*

胡 越1,刘 莉2,熊威威3,谭 毅3,黄志华3,李爱国3,杨 华4，蒋奕红3△

(1.桂林医学院研究生院,广西桂林 541001；2.湖北省武汉市第三医院麻醉科 430000; 3.桂林医学院附属医院麻醉科,广西桂林 541001;4.桂林医学院附属医院中医科，广西桂林 541001)

目的 探讨不同穴位电针刺激复合七氟烷麻醉对断尾大鼠急性应激反应调控作用的影响。方法 健康成年雄性SD大鼠50只，体质量280～320 g，分为正常组(Ⅰ组)、模型组(Ⅱ组)、七氟烷吸入组(Ⅲ组)、七氟烷吸入加体针组(Ⅳ组)和七氟烷吸入加耳针组(Ⅴ组)，每组10只。Ⅰ组不作处理置于氧流量30%的混合气体玻璃箱中(流量2 L/min)，Ⅱ组断尾后置于氧流量30%的混合气体玻璃箱中(流量2 L/min)，Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组断尾后置于含体积分数为2%的七氟烷麻醉箱中(流量2 L/min)，Ⅳ组持续刺激双侧“足三里”穴30 min (刺激参数3 V，3 Hz，2 ms)，共4次，每次间隔30 min，Ⅴ组刺激双侧“耳尖”穴，刺激参数及时间同Ⅳ组。各组治疗方法结束后，处死各组大鼠，取断颈血采用ELISA测促肾上腺皮质激素(ACTH)和外周血皮质酮(CORT)水平。采用Western blot法测定下丘脑组织c-fos蛋白的表达水平。结果 与Ⅰ组相比，Ⅱ组血清ACTH、CORT水平、下丘脑c-fos蛋白表达明显升高(P<0.01)；与Ⅱ组相比，Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组大鼠外周血ACTH、CORT水平均有所下降,差异有统计学意义(P<0.05)；Ⅲ组与Ⅳ组的ACTH和CORT水平差异无统计学意义(P>0.05)；Ⅴ组的ACTH水平与Ⅲ组相比明显下降(P<0.05)，Ⅴ组CORT水平与Ⅳ组相比明显下降(P<0.05)。Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组c-fos表达与Ⅱ组相比均降低(P<0.05)，Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组3组组间差异有统计学意义(P<0.05)。结论 七氟烷吸入复合电刺激“耳尖”穴治疗时，对应激的作用优于单纯的七氟烷治疗和七氟烷复合电刺激“足三里”穴。电针复合吸入全身麻醉对应激的调控机制可能与下丘脑调节室旁核c-fos蛋白分泌并影响下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴有关。

应激；电针；原癌基因蛋白质c-fos；七氟烷；耳针

应激(stress) 是机体对各种刺激产生的一些非特异性反应。机体主要是通过下丘脑-垂体-肾上腺皮质(HPA)轴分泌的应激激素来调节并完成对应激的适应。HPA多以外周血中促肾上腺皮质激素(ACTH)和皮质酮(CORT)水平变化作为应激调控的外周指标[1]，以c-fos蛋白作为中枢调控应激的敏感因子[2]。研究表明，电针复合全身麻醉可降低肺切除患者围术期的应激反应[3]，电针复合颈丛阻滞也能显著降低甲状腺患者围术期的应激反应[4]。临床应用多以体针复合麻醉，而实际操作中体针多受手术操作及体位的局限，而耳针不仅操作灵活且便于术中管理。但目前耳针复合麻醉对应激的调控作用不明。本研究通过对外周血清ACTH、CORT水平和下丘脑c-fos蛋白表达的变化，探讨电针体穴和耳穴复合全身麻醉对断尾大鼠应激反应的影响，为临床应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物 取50只成年雄性SD大鼠(桂林医学院动物实验中心提供)，体质量280～320 g,按照昼夜节律性饲养，即在12 h光照和12 h黑暗的条件下喂养,自由摄食和饮水。动物在实验环境中适应1周后进行正式实验。

1.2 试剂及仪器 大鼠ACTH、CORT ELISA试剂盒(华美Cusabio公司)，兔抗人多克隆c-fos抗体(1∶1 000，Santa Cruz公司)，山羊抗兔辣根标记二抗 (1∶5 000)、山羊抗小鼠辣根标记二抗(1∶5 000)、DAB(Sigma公司)，鼠抗β-actin(1∶1 000，中杉金桥公司)，SAB试剂盒(武汉博士德生物技术公司)。仪器：华佗牌SDZ-Ⅱ型电子针疗仪(苏州医疗用品厂生产)，Bio-Rad蛋白电泳系统、Bio-Rad电转膜仪、七氟烷挥发罐(Datex-Ohmeda公司)，ALC-V8动物呼吸机(上海奥尔特生物科技有限公司)，麻醉气体监护仪(Datex-Ohmeda)，IPP6.0凝胶成像系统。

1.3 方法

1.3.1 动物分组 采用随机数字表达法分为5组,分别为正常组(Ⅰ组)、模型组(Ⅱ组)、七氟烷吸入组(Ⅲ组)、七氟烷吸入加体针组(Ⅳ组)和七氟烷吸入加耳针组(Ⅴ组)，每组10只。

1.3.2 急性应激模型制备 大鼠常规饲养，除Ⅰ组外各组大鼠采用低位尾干切断(ICTR)的方法模拟急性应激，即用鼠笼固定大鼠后，在靠近尾端的尾干处(S3和S4脊髓神经之间)横切。

1.3.3 处理方法和取材 参照Lee等[5]的方法，Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组大鼠均通入体积分数2%的七氟烷气体。将大鼠放入体积约为30 cm×20 cm×20 cm的玻璃麻醉箱中，箱底铺满石灰，用Ohmeda挥发罐给予七氟烷行麻醉诱导和维持，Datex麻醉气体监护仪与气管导管连接，用于监测呼气末七氟烷水平，使箱内七氟烷的水平维持在2%，再将大鼠置入玻璃箱。对Ⅳ组和Ⅴ组进行电针刺激治疗，在翻正反射消失后，将大鼠从七氟烷麻醉箱中迅速拿出，接上电针后立即放回麻醉箱中。按照《实验针灸学》[6]进行取穴：Ⅳ组取“足三里”对应大鼠的后三里位于膝关节后外侧腓骨小头下约5 mm处胫腓骨间，直刺7 mm，给予“疏密波”，参数设置为3 V，3 Hz，2 ms[7]。取穴完成后，迅速放回体积分数维持在2%的七氟烷麻醉箱中，电针刺激30 min 1次，每2次间隔30 min，共4次电刺激治疗。Ⅴ组在“耳尖”穴：位于耳尖后缘，针刺时沿耳廓横刺2 mm，各项刺激参数、持续时间同Ⅳ组。处理结束时，各组大鼠断颈取血5 mL，随后取下丘脑组织置于液氮中，以备检测以下指标。

1.3.4 血清ACTH、CORT水平的检测 血样加入不凝管中，在常温下静置2 h后，4 ℃，3 500 r/min，离心15 min，取上清液-20 ℃保存，采用ELISA试剂盒检测ACTH和CORT水平，严格按照试剂盒说明操作。

1.3.5 下丘脑组织c-fos蛋白水平测定 待测时将组织从液氮中取出，用液氮研磨并裂解后，提取蛋白质,进行蛋白定量,用Western blot法检测下丘脑组织c-fos蛋白的变化。按5 μg/mL的比例将组织裂解液加入到下丘脑组织内,匀浆后,12 000 r/min离心吸取上清液测定总蛋白含量(BCA蛋白测定法)。取40 μg蛋白质,加热变性后,进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白,用电转膜仪(Bio-Rad)将凝胶上的蛋白质转印到聚二偏氟乙烯(PVDF)膜上，用含10%脱脂奶粉和0.1% Tween-20的Tris缓冲液 (TBST) 常温封闭60 min,然后进行免疫杂交反应。首先加入1∶1 000的兔来源的c-fos抗体(Santa Cruz公司),4 ℃孵育过夜。用新鲜配制的TBST洗涤后,加入山羊抗兔抗体二抗,抗体滴度为1∶5 000,室温孵育78 min。用TBST洗涤后,在暗室内加增强化学发光剂 (West Pico),压X线片(柯达)。同一Western杂交膜显示c-fos条带后,用TBST洗涤PVDF膜30 min,然后用同样的方法显示β-actin条带,以此作为加样的内参照。X 线片上的条带经凝胶成像系统读其灰度值,并进行定量。以c-fos条带灰度值/β-actin条带灰度值来纠正上样量的偏差。用灰度比值的高低表示c-fos蛋白水平的多少。

2 结 果

2.1 各组外周血血清ACTH、CORT水平比较 与Ⅰ组相比，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组血清ACTH、CORT水平明显升高(P<0.01)。与Ⅱ组相比，Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组ACTH、CORT水平均有不同程度下降(P<0.05)。Ⅲ组与Ⅳ组的ACTH和CORT水平差异无统计学意义(P>0.05)；而Ⅴ组的ACTH水平与Ⅲ组相比明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)，Ⅴ组的CORT水平与Ⅲ组相比差异无统计学意义(P>0.05)。Ⅳ组与Ⅴ组相比，两组间ACTH水平差异无统计学意义(P>0.05)，但CORT水平Ⅴ组较Ⅵ组低 (P<0.05)，见表1。

表1 各组大鼠血清ACTH、CORT水平比较(±s，n=10)

a：P<0.01，与Ⅰ组比较;b:P<0.05，与Ⅱ组比较；c:P<0.05,与Ⅲ组比较；d:P<0.05,与Ⅳ组比较。

2.2 各组下丘脑组织c-fos蛋白表达情况 Ⅰ组c-fos表达很少，断尾应激后，Ⅱ组c-fos表达明显上调(P<0.01)，与Ⅱ组相比，Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组c-fos表达减少(P<0.01)；与Ⅲ组比较，Ⅳ、Ⅴ组的c-fos表达均下调(P<0.01)；Ⅳ、Ⅴ组间表达有差异，且Ⅴ组表达低于Ⅳ组(P<0.01)，见图1、表2。

图1 各组下丘脑c-fos蛋白Western印记X-线片显影结果

组别nc⁃fos蛋白表达Ⅰ组100．16(0．15，0．18)Ⅱ组101．91(1．89，1．92)aⅢ组101．13(1．12，1．14)abⅣ组101．02(1．00，1．04)abcⅤ组100．66(0．60，0．73)bcd

a：P<0.01，与Ⅰ组比较；b：P<0.01，与Ⅱ组比较；c：P<0.01，与Ⅲ组比较；d：P<0.01，与Ⅳ组比较。

3 讨 论

本研究参照Xu等[8]采取低位尾干切断的方法制造急性创伤性应激的模型，操作简便且模型效果显著。有研究证实[9]，电针“足三里”可通过抑制下丘脑神经元进而调整HPA轴功能异常，以减轻急性创伤大鼠术后应激。同时，电针大鼠“耳尖”穴对慢性应激也有一定的调控作用[10]。固选取“足三里”和“耳尖”复合全身麻醉进行效果对比。

c-fos蛋白的表达被广泛认为是神经元兴奋的标志[11]。在非应激的基础状态,脑部c-fos表达水平很低；由张云东等[12]的研究结果可知，创伤后应激早期下丘脑c-fos快速表达，但促肾上腺素释放激素(CRH)的表达迟于c-fos的表达过程,说明创伤应激反应中下丘脑早期表达的c-fos可能起激活CRH基因表达的作用。并有研究表明[13]，急性疼痛应激传入后,激活下丘脑室旁核(PVN)c-fos mRNA转录，表达c-fos蛋白，并作为第3信使与CRH mRNA位点结合激活CRH mRNA转录，使下丘脑释放CRH至垂体并入血，从而启动HPA轴。本研究结果显示，断尾给予的急性刺激后，外周血中血清ACTH和CORT水平显著升高，且下丘脑c-fos表达升高，即急性应激模型制备成功，随后在给予电针加七氟烷吸入后，c-fos表达降低，可能的机制为电针复合七氟烷作用后大鼠下丘脑激活的c-fos神经元减少，则转录合成的CRH也随之减少。因此，CRH激活HPA轴后释放入血的ACTH水平也随之降低，ACTH刺激肾上腺皮质释放的CORT也同时减少。有实验证实[14]，电针“百会”“神门”等穴可下调血清CORT和ACTH水平,作用机制可能与电针调节HPA轴的功能有关；临床上将电针复合七氟烷麻醉用于神经外科手术中，也验证了电针复合麻醉作用对术后早期镇痛和恢复有良好的效果[15]。在本实验中，电针复合七氟烷全身麻醉作用后，升高的外周血清ACTH和CORT水平均有不同程度的回落，即证实了电针联合七氟烷吸入全身麻醉对应激的调控作用是有效的，而各治疗组大鼠的下丘脑c-fos蛋白表达降低证实下丘脑调控HPA轴跟通过减少c-fos蛋白表达有关。

实验中发现，Ⅳ与Ⅴ组作用效果比较时，Ⅴ组对应激下调的作用强于Ⅳ组，即电刺激“耳尖”穴复合七氟烷麻醉对断尾应激的调控优于电刺激体穴“足三里”复合七氟烷全身麻醉。相比于体穴，耳部有丰富的迷走神经分布。应激传入兴奋交感神经启动HPA轴，电针刺激耳穴时，一方面可以通过下丘脑系统调节交感神经和副交感神经的平衡，兴奋迷走胆碱能神经纤维抑制交感肾上腺素能作用，调节激素水平变化[16]；另一方面能通过激活镇痛机制，抑制痛觉信号传递，达到镇痛作用从而降低疼痛诱发的应激反应[17]。多途径多系统的参与可能是耳穴复合七氟烷全身麻醉作用优于体穴的原因。

总之，电针复合七氟烷麻醉法对急性应激的调控有明确效果，其机制与PVN分泌c-fos蛋白有关，耳针复合七氟烷比体针复合七氟烷的调控作用效果好。电针复合药物麻醉应用于临床时，不仅可以有效减轻围麻醉期应激反应的作用，还对预防术后疼痛及术后恶心呕吐等术后并发症的发生有显著作用[18]，值得临床大力推广。

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Effect of electro-acupuncture combined with sevoflurane anesthesia on regulation of acute stress response in docked tails rats*

HuYue1，LiuLi2，XiongWeiwei3，TanYi3，HuangZhihua3，LiAiguo3，YangHua4,JiangYihong3△

(1.GraduateSchool，GuilinMedicalCollege,Guilin,Guangxi541001,China;2.DepartmentofAnesthesiology,ThirdHospitalofWuhanCity,Wuhan,Hubei430000,China;3.DepartmentofAnesthesiology，AffiliatedHospitalofGuilinMedicalCollege，Guilin，Guangxi541001,China;4DepartmentofTraditionalChineseMedicine，AffiliatedHospitalofGuilinMedicalCollege，Guilin,Guangxi541001，China)

Objective To investigate the effect of electro-acupuncture combined with sevoflurane anesthesia on the regulation of acute stress response in docked tails rats．Methods Fifty male SD rats weighing 280-320 g were randomlsy divided into 5 groups(n=10 each)：normal group (group Ⅰ),model group (group Ⅱ),sevoflurane group (group Ⅲ),sevoflurane inhalation combined with body acupuncture group (group Ⅳ) and sevoflurane combined with auricular acupuncture group (group Ⅴ).The group Ⅰwas placed in a glass box containing mixture gas with oxygenflow of 30% (flow 2 L/min) without treatment,the group Ⅱafter docking tail was placed in a glass box containing mixture gas with oxygenflow of 30% (flow 2 L/min),the group Ⅲ,Ⅳ and Ⅴ were placed in the 2% sevoflurane anesthesia box (flow 2 L/min),the group Ⅳ was given continuous stimulation at Zusanli (stimulation parameters:3 V，3 Hz，2 ms) for 30 min per time,4 times at intervals of 30 min,the groupⅤ was given the stimulation at Erjian with the same stimulation parameters as the groupⅣ.Rats in each group were killed after treatment and the blood at broken neck was collected for measuring serum corticosterone (CORT) and adrenocorticotropic hormone (ACTH) levels by ELISA.The c-fos protein expression level in hypothalamic tissue was detected by Western blot.Results Compared with the group Ⅰ,serum ACTH,CORT levels,hypothalamic expression of c-fos protein in the group Ⅱwere significantly increased (P<0.01),compared with the group Ⅱ,the peripheral blood ACTH,CORT levels were decreased with statistical difference (P<0.05);the ACTH,CORT levels had no statistical difference between the group Ⅲ and Ⅳ(P>0.05);the ACTH level in the groupⅤ was significantly decreased compared with the groupⅢ(P<0.05) and the CORT level in the group Ⅴ was also decreased when compared with the group Ⅳ(P<0.05).The c-fos expression in the groupⅢ,Ⅳ and Ⅴwere decreased compared with the groupⅡ(P<0.05),there were significant difference among the group Ⅲ,ⅣandⅤ(P<0.05).Conclusion In the treatment of sevoflurane inhalation anesthesia combined with compound electrostimulation at Erjian,its effect on stress response is superior to simple sevoflurane treatment and sevoflurane combined with compound electrostimulation at Zusanli.The regulation mechanism of electro-acupuncture combined with inhalation general anesthesia on stress may be related with hypothalamus regulating paraventricular nucleus c-fos protein secretion and affecting the HPA axis.

stress;electroacupuncture;proto-oncogene proteins c-fos;sevoflurane;auricular acupuncture

2013年广西中医药民族医药继承创新工程(GZZC13-20)。

胡越(1989-)，在读硕士，主要从事围术期的应激调控及术后并发症的防治研究。
△

，E-mail:jiangyihong@163.com。

��·基础研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.10.003

R245.97;R614

A

1671-8348(2016)10-1306-03

2015-11-18

2015-12-28)