电场对内皮祖细胞迁移行为及形态的影响

胡雪飞，程 勇，文 星，王永飞，王 强，许喜生△

(1.南华大学附属郴州市第一人民医院烧伤整形科,湖南郴州 423000； 2.广东省清远市人民医院烧伤整形科 511500)

电场对内皮祖细胞迁移行为及形态的影响

胡雪飞1，程 勇2，文 星1，王永飞1，王 强2，许喜生1△

(1.南华大学附属郴州市第一人民医院烧伤整形科,湖南郴州 423000； 2.广东省清远市人民医院烧伤整形科 511500)

目的 探讨外加电场对体外培养的内皮祖细胞(EPCs)迁移行为及形态的影响。方法 将体外培养的3～4代EPCs分别用场强为0 mV/mm(Ⅰ组)、100 mV/mm(Ⅱ组)、200 mV/mm(Ⅲ组)和300 mV/mm(Ⅳ组)的直流电场加以持续刺激3 h，活细胞工作站实时记录细胞迁移轨迹及形态变化，分析外加电场对EPCs迁移行为及形态的影响。结果 Ⅳ、Ⅲ、Ⅱ组细胞向阳极定向迁移，Ⅰ组细胞显示随机运动。电刺激3 h时，细胞轨迹迁移速率(Vt)、位移速率(Vd)、电场方向迁移速率(Vx)分别为：Ⅳ组[(98.86±6.00)、(63.78±2.81)、(63.15±2.88)μm/h]、Ⅲ组[(88.06±8.83)、(35.90±1.22)、(34.20±1.57)μm/h]和Ⅱ组[(42.28±2.25)、(13.29±0.37)、(12.39±0.51)μm/h]，均显著高于Ⅰ组的[(37.39±2.42)、(6.99±0.31)、(4.62±0.40)μm/h],均P<0.01,且Ⅲ组细胞Vt、Vd、Vx均显著高于Ⅱ组、Ⅰ组(均P<0.01)。EPCs在电场刺激下发生明显的形态变化，细胞外观变得狭长，逐渐与电场方向平行排列。结论 外加直流电场可诱导EPCs向阳极迁移并加快其迁移速率，且对EPCs的形态有明显影响。

电场；内皮祖细胞；趋电性；细胞迁移

内源性生物电场(endogenous electric fields)对机体损伤愈合及功能恢复具有重要作用，使用药物或外加极性相反的电场消除内源性电场可阻碍上述进程，而增强该内源性电场可加快病变部位愈合速度和改善愈合质量[1-2]。血管修复作为损伤修复的重要分支，探寻促进血管修复的方法已被众多科研工作者关注。已有研究表明，电刺激通过影响内皮细胞的生物学特性，对血管修复起着重要的积极作用[3]。然而，内皮细胞作为终末分化类型的细胞，其对血管重建的作用十分有限[4]，这也限制了电刺激在血管修复方面的研究。内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)作为血管内皮细胞的前体细胞，可在缺血、缺氧等诱导下向病损部位归巢[5]，对于血管修复与形成的实现更有应用价值。指导EPCs定向迁移对于促进血管损伤修复与创面愈合具有重要临床意义，因此，本研究观察了外加电场对体外培养的EPCs生物学行为的影响,为电刺激促进血管修复的研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物、主要试剂与仪器来源 清洁级同种系雄性C57B/6J小鼠，6～8周龄，由第三军医大学大坪医院野战外科研究所实验动物中心提供。DMEM/F12培养基(Hyclone公司，美国)，胎牛血清(Gibco公司，澳大利亚)，小鼠单个核细胞分离液(密度1.090，天津灏洋生物制品科技有限公司，中国)，胰蛋白酶、EDTA(Biosharp公司，中国)，FITC标记的荆豆类凝集素(FITC-UEA,Sigma公司，美国),DiI-乙酰化低密度脂蛋白 (DiI-acLDL,Molecular Probe 公司)；CO2培养箱(Thermo Forma公司，美国)，倒置显微镜(Olympus公司，日本)，活细胞工作站(Applied Precision公司，美国)，Imaries 6.5 软件(Bitplane公司，瑞士)。

1.2 电场刺激装置细胞培养小室的制备 直流电场模拟生理电场干预装置参照Song等[6]的方法进行改良制作，原理图见图1。制作简述如下：使用康道宁绝缘硅脂硅基复合物4(DC4)将盖玻片(50.00 mm×12.00 mm×0.15 mm)比照图纸(图1A)粘贴至培养皿(直径10 cm)内，使其与培养皿底面紧密接触，再用DC4 将密封条和培养皿内缘连接，阻断培养基自由流动，即制作成趋电小室，密封条间形成50.00 mm×20.00 mm×0.15 mm的区域维度用于接种细胞，该区域可使场强和电流均匀分布。再将其与盐桥、Steinberg 缓冲液、银丝、电线、输出电源构成完整的趋电装置(图1B)。

A：趋电小室示意图；B：内源性生物电场模拟趋电装置示意图。

图1 内源性生物电场模拟装置

1.3 方法

1.3.1 EPCs的分离、培养及鉴定 具体方法参照文献[7]。

1.3.2 电场刺激 将3～4代骨髓来源小鼠EPCs均匀接种于趋电小室，培养24 h后,更换培养基，分别用强度为100 mV/mm(Ⅱ组)、200 mV/mm(Ⅲ组)和300 mV/mm(Ⅳ组)的电场连续电刺激3 h，活细胞工作站实时记录电场刺激下细胞迁移轨迹及形态，0 mV/mm组(Ⅰ组)细胞作为对照。

2 结 果

2.1 EPCs鉴定 细胞形态学鉴定：分别于接种后0、1、3、7、14 d在相差显微镜下观察细胞形态学特征，原代EPCs培养约48 h开始贴壁，3 d后换液可见贴壁细胞呈圆形、短梭形或多角形，7 d时克隆上基本无圆形细胞附壁，10～15 d细胞约70%融合，局部密集区呈铺路石样排列。双吞实验鉴定细胞表型：通过荧光显微镜鉴定发现，同时摄取DiI-acLDL和FITC-UEA的双染阳性细胞的比例达90%，表明贴壁细胞为正在分化的EPCs。

图2 细胞迁移方向及速率的量化方法示意图

2.2 电场下EPCs迁移能力检测 Ⅰ组EPCs迁移方向是随机的(图3A、B、E)；Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组EPCs向阳极定向迁移，且细胞逐渐变得狭长，细胞长轴逐渐与电场方向平行(图3C、D、F)。细胞定向迁移能力与场强呈正相关(图3G)，场强越大，cosθ值越大，定向迁移越明显，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组cosθ值均较Ⅰ组大，Ⅳ组cosθ值亦均较Ⅲ组、Ⅱ组大(P<0.01),见表1。EPCs迁移速率Vt、Vd、Vx均与场强呈正相关(图3H)，与Ⅰ组比较，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组Vt、Vd、Vx均明显升高(P<0.01)；Ⅲ组Vt、Vd、Vx均高于Ⅱ组(P<0.01)，Ⅳ组细胞Vt、Vd、Vx均显著高于Ⅲ组和Ⅱ组(P<0.01)，见表2。EPCs受电场刺激后，细胞出现伸长反应，其外观呈狭长梭形,逐渐与电场方向平行排列，见图3C、D。其细胞长短轴比值在Ⅳ组电场中1、2、3 h分别为2.966±0.059、4.183±0.068和6.243±0.098,与Ⅰ组0 h时细胞比值(2.219±0.084)相比明显增加(均P<0.01)。

表1 4组EPCs各时相点cosθ值比较(±s)

a：P<0.01,与Ⅰ组比较；b：P<0.01，与Ⅱ组比较；c：P<0.01，与Ⅲ组比较。

表2 4组EPCs迁移速率的比较(±s，μm/h)

a：P<0.01,与Ⅰ组比较；b：P<0.01，与Ⅱ组比较；c：P<0.01，与Ⅲ组比较。

A、B、E：无电场时EPCs前后3 h的形态及迁移轨迹；C、D、F：电场下EPCs前后3 h的形态及迁移轨迹，原点(0，0)为细胞运动的起点；G：不同场强下及各时间点细胞的cosθ值；H：不同场强作用3 h时细胞的平均移行速率；a：P<0.01，与Ⅰ组比较；b：P<0.01，与Ⅱ组比较，c:P<0.01，与Ⅲ组比较。

图3 电场作用下EPCs的迁移

3 讨 论

生物电现象普遍存在于生命体内，胚胎发育、组织再生、创面愈合等都需要生物电的参与。细胞膜两侧正负离子的流动产生跨细胞电势差，当机体组织细胞因生理或病理因素产生结构改变时，原有电势差改变，产生内源性电场[9]。大量实验数据表明，通过外加一定强度的电场增强内生电场，可加快病变部位愈合速度和改善愈合质量[1-2，10-11]。血管乃全身的命脉系统，机体的各种创伤、缺血损伤无不伴随血管的损伤，同时也伴随生物电的改变。因此，通过外加电场调整病灶部位内生物电场进行血管修复不失为一种有效的方法。目前，电刺激在血管修复方面的研究已取得了不少成绩，其研究的对象主要是血管内皮细胞，电刺激可能通过作用于内皮细胞来调控血管生成[12]。通过对血管内皮细胞电刺激研究发现，适宜的电刺激强度可促进血管再生与修复。然而，血管内皮细胞作为终末分化类型的细胞,其迁移、增殖能力十分有限，不能满足血管修复与再生的需要；EPCs 作为血管内皮细胞的前体细胞，其强大的增殖分化潜能已被众多科学家所关注[13]。EPCs存在于骨髓和外周血中，可向损伤部位迁移或归巢[14]。许多因素调控着EPCs向损伤血管或血管生成部位归巢，具体机制尚不清楚。趋化因子和细胞因子，如血管内皮生长因子等，影响EPCs的数量和迁移[14-15]。发展促进EPCs迁移的有效方法及对EPCs向损伤和血管形成部位归巢具体机制的认识具有重要临床意义。

本研究通过建立外源性电刺激装置模拟内源性生物电场，探讨电刺激下EPCs迁移行为的改变。研究结果显示，EPCs可在外源性电场的刺激下向阳极定向迁移，场强越大，定向迁移越明显，而对照组迁移方向随机；各电刺激组细胞的迁移速率均较对照组显著增强，且迁移速率随电场刺激强度的增强而加快；各电刺激组细胞形态变得狭长，其长轴与电场方向平行，且场强越大，狭长形态越明显，而对照组形态变化不明显。提示内源性生物电场具有促进 EPCs向阳极定向迁移的能力并能提高迁移速率，并能改变细胞形态。此外，本实验还发现EPCs不能耐受大于300 mV/mm的电场强度，350 mV/mm的场强对其进行刺激时，即开始出现部分EPCs死亡的现象。提示本实验条件下，300 mV/mm的场强刺激时，EPCs定向迁移最明显，迁移速率最快，同时细胞可以耐受。因此，在本实验中，300 mV/mm的场强为促进EPCs迁移的最佳电场强度。

综上所述，本实验结果提示电刺激能够诱导体外培养的 EPCs向阳极定向迁移，且迁移速率与一定范围内的场强强度呈正相关，300 mV/mm的场强为促进EPCs迁移的最佳电场强度；EPCs在电场下形态逐渐变得狭长，其细胞长轴与电场方向平行。产生此种现象的具体机制尚不明确。细胞迁移是血管新生的前提，电场促进EPCs定向迁移有望促进血管生成。电刺激下EPCs生物学特性改变的研究促进了电刺激促进血管新生的相关研究，最终可为电刺激在血管损伤如缺血、创伤等病变中的应用提供新的理论依据，同时也可为其他治疗方法中EPCs的应用提供新思路。

然而，在血管生成中，电场对EPCs分化形成血管的能力是否存在影响也值得进一步研究。本实验初步探讨了电场对EPCs迁移的影响，电场是否同时存在对细胞分化能力的影响。已有研究表明，电场能够促进心肌干细胞向心肌细胞分化，促进神经干/祖细胞向神经元分化[16]，促进人胚胎干细胞向心肌细胞分化[17]，提示电场可能是促进细胞分化的重要因素。因此，电场对EPCs分化形成血管能力的影响值得进一步探索。

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Influence of electric fields on migration behavior and morphology of endothelial progenitor cells

HuXuefei1,ChengYong2,WenXing1,WangYongfei1,WangQiang2,XuXisheng1△

(1.DepartmentofBurnsandPlasticSurgery,AffiliatedChenzhouMunicipalFirstPeople′sHospital,UniversityofSouthChina,Chenzhou,Hunan423000，China;2.DepartmentofBurnsandPlasticSurgery,People′sHosptialofQingyuan,Qingyuan,Guangdong511500,China)

Objective To investigate the influence of external electric fields on migration behavior and morphology of endothelial progenitor cells (EPCs) cultured in vitro.Methods The in vitro cultured 3-4 generation EPCs were continuously stimulated by direct-current electric field with the field intensity of 0 mV/mm(group Ⅰ),100 mV/mm(group Ⅱ),200 mV/mm(group Ⅲ) and 300 mV/mm(group Ⅳ)for 3 h.The live cell station was used to real time record the cell migration track and morphology change of EPCs.The influence of external electric field on the EPCs migration behavior and morphology was analyzed.Results Under the stimulation of the direct-current electric field with the intensity of group Ⅳ,group Ⅲ and group Ⅱ,the cells were directly migrated to anode,while the cells under group Ⅰ displayed the random motion.The track migration velocity(Vt)、displacemnt velocity(Vd) and electric field direction migration rate(Vx) were(98.86±6.00),(63.78±2.81),(63.15±2.88)μm/h for the group Ⅳ,(88.06±8.83),(35.90±1.22),(34.20±1.57)μm/h for the groupⅢ,(42.28±2.25),(13.29±0.37),(12.39±0.51)μm/h for the groupⅡ,which were significantly higher than(37.39±2.42),(6.99±0.31),(4.62±0.40)μm/h for the groupⅠ(P<0.01),moreover Vt,Vd and Vx in the group Ⅲ were significantly higher than those in the group Ⅱ andⅠ(P<0.01).EPCs had obvious morphological changes under the electric field action,such as elongation and the cellular long axis parallel to the electric field direction.Conclusion External direct current electric fields may induce the directed migration of EPCs towards the anode,accelerates the migration rate,moreover has obvious influence on EPCs morphology.

electric fields;endothelial progenitor cells;galvanotaxis;cell migration

胡雪飞(1987-),在读硕士，主要从事烧伤外科学研究。△

，E-mail:13762590230@163.com。

��·基础研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.10.006

R622

A

1671-8348(2016)10-1316-04

2015-12-18

2016-01-25)