重组人乳铁蛋白对幽门螺杆菌抑菌作用的实验研究*

罗 娟，成国祥，袁渝萍，张爱民，刘雪芳，刘思国，边 莉，陈建泉，张 磊，董向前，杨 刚，南 琼，马岚青△

(1.云南省消化疾病研究所/昆明医科大学第一附属医院消化内科，昆明 650032；2.杰隆生物工程有限公司，上海 200000；3.昆明医科大学第一附属医院病理科 650032)

重组人乳铁蛋白对幽门螺杆菌抑菌作用的实验研究*

罗 娟1，成国祥2，袁渝萍1，张爱民2，刘雪芳1，刘思国2，边 莉3，陈建泉2，张 磊1，董向前1，杨 刚1，南 琼1，马岚青1△

(1.云南省消化疾病研究所/昆明医科大学第一附属医院消化内科，昆明 650032；2.杰隆生物工程有限公司，上海 200000；3.昆明医科大学第一附属医院病理科 650032)

目的 评估重组人乳铁蛋白(rhLF)对幽门螺杆菌(H.pylori)的抑菌作用及其对细胞毒素相关蛋白A(CagA)、尿素酶(Ure)和胃黏膜白细胞介素8(IL-8)的影响。方法 测定最低抑菌浓度(MIC)和不同药物浓度对H.pylori增殖的影响。通过实时定量PCT和Western blot检测rhLF对H.pylori CagA和Ure的mRNA和蛋白表达的影响。动物实验，144只BABL/c小鼠，分为4组，标准三联+rhLF组(A组)、rhLF组(B组)、标准三联组(C组)、生理盐水组(D组)，组织病理学苏木素-伊红(HE)染色观察不同分组间胃黏膜炎性反应,ELISA法检测各组胃组织IL-8水平。结果 MIC为0.5 mg/mL,且rhLF抑制细菌生长增殖呈现浓度依赖性过程。rhLF能降低H.pylori主要毒力因子CagA、Ure mRNA和蛋白的表达。A组胃黏膜组织炎症积分和匀浆液IL-8水平与B、C、D组比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 rhLF抑制H.pylori生长及增殖，并不同程度抑制H.pylori主要毒力因子CagA、Ure mRNA及蛋白的表达，削弱该菌的致病性，同时降低小鼠胃黏膜IL-8水平，减轻H.pylori相关性胃黏膜炎性反应。

螺杆菌，幽门；乳铁蛋白；细胞毒素相关蛋白A；尿素酶；白细胞介素8

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，H.pylori)是引起慢性胃炎和消化性溃疡的常见病原菌[1-2]，它的致病性与其分泌的许多毒力因子相关，包括尿素酶(Ure)、细胞毒素相关蛋白A(CagA)和空泡毒素A等[3-5]。这些毒力因子在引起病变的过程中发挥不同的作用，其中CagA是H.pylori最重要的毒力因子之一[6]，由CagA基因编码。CagA与胃上皮表面相互作用引起级联反应，强烈干扰细胞的信息传导通路，通过各种机制引起病理性细胞应答，如活力、程序性细胞凋亡和形态学的改变。实验研究表明，慢性胃炎程度与CagA的阳性率相关，提示CagA与炎性细胞的浸润有关[7]。Ure对H.pylori有保护作用[8]，但对宿主直接毒性作用造成胃黏膜屏障的损害，并且通过免疫反应和炎性反应引起损伤。CagA能诱导胃黏膜组织产生更多的白细胞介素8(IL-8)，从而加强H.pylori对胃黏膜损伤的作用。近年来H.pylori根除率呈逐年下降趋势，其对抗菌药物的耐药率逐年增加[9-11]，故寻找非抗菌药物的其他治疗成为必要。

乳铁蛋白(lactoferrin)是哺乳动物体内一种重要的非血红素铁结合糖蛋白[12]，具有抗炎性反应、免疫调节和铁离子结合功能。乳铁蛋白被认为是一种天然免疫因子和广谱抗菌剂[13]，国外已有少数报道牛乳铁蛋白抗H.pylori的效果，但乳铁蛋白抗H.pylori作用的结论具有不确定性。本文旨在探讨重组人乳铁蛋白(recombinant human lactoferrin,rhLF)抗H.pylori作用及相关机制的研究，为rhLF联合基础方案治疗H.pylori感染提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及动物 H.pylori国际标准菌株ATCC43504由上海交通大学附属仁济医院消化内科陆红教授馈赠；健康成年BABL/c小鼠，体质量20～25 g，由昆明医科大学动物实验室提供。

1.1.2 实验药物及试剂 rhLF由杰隆生物工程有限公司提供；哥伦比亚培养基、脑心浸液培养基购自青岛海博；胎牛血清购自美国Thermo Fisher 公司，微需氧产气袋购自日本Mitsubishi公司，混合抗菌药物购自北京宝生物公司，实时定量PCR(RT-PCR)试剂盒购自日本Takara公司；抗-CagA抗体、抗-Ure抗体购自美国Santa公司。

1.1.3 主要仪器设备 密闭厌氧盒(日本Mitsubishi公司)；超净工作台(上海智城分析仪器制造有限公司)；电热恒温培养箱(上海精宏试验设备有限公司)；快速梯度PCR仪(德国Effendorf公司)；ABI Prism 7000型荧光定量PCR仪(美国应用生物系统公司)；真空冻干机(SP公司VirTis,2KBTES-55)

1.2 方法

1.2.1 H.pylori的培养和鉴定 H.pylori菌株接种于制备好的哥伦比亚完全培养基中，均匀涂布，厌氧培养盒中微需氧产气袋环境下,恒温培养箱中37 ℃恒温培养3～5 d后进行菌种鉴定，取对数生长期细菌，采用无菌磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后测细菌光密度(OD)600 nm值(OD=1×109CFU/L),调整细菌浓度为1×109CFU/L进行后续实验。

1.2.2 测定rhLF对H.pylori最低抑菌浓度(MIC) 分别采用固体及液体法按照美国临床实验标准化委员会(NCCLS)制订的倍比稀释法经预实验了解rhLF抑菌的浓度范围后，将rhLF以4 mg/mL开始作连续6次倍比稀释，制备成各种浓度的培养基，使rhLF的终浓度为：2.000、1.000、0.500、0.250、0.125、0.063 mg/mL,取100 μL 1×109cfu/L对数生长期菌液接种于含不同药物浓度的培养基中，每个浓度做3个复板，固体培养基上培养3 d后观察细菌生长情况，液体培养基中培养48 h后再接种于固体培养基中培养3 d。以无细菌生长平皿的最小药物浓度作为该药物的MIC。

1.2.3 rhLF、Fe3+对H.pylori生长的影响 H.pylori培养于含不同rhLF浓度的脑心浸液液体培养基的24孔细胞培养板中，固定培养板，37 ℃，180 r/min,恒温振荡培养，分别于0、8、16、24、32、40、48、56、64 h测定细菌菌液OD600 nm并更换一次产气袋，观测rhLF对细菌生长曲线的影响。并在MIC环境中加入不同浓度的高氯酸铁或柠檬酸铁拮抗rhLF铁结合能力，观察H.pylori生长情况。

1.2.4 RT-PCR 使用Trizol试剂提取不同rhLF浓度作用下的H.pylori总RNA，测定各样本的OD260 nm和OD280 nm，并行普通电泳检测RNA质量，选取OD260 nm/OD280 nm>1.8，RNA质量佳者进行后续实验，用相当于1 μg RNA采用primeScriptTMRT reagent kit with gDNA Eraser(Takara)试剂盒，两步法进行逆转录反应，体系及方法具体参照试剂盒说明书进行。按照SYBR®Premix Ex TaqTM Ⅱ(Tli RNaseH Plus)试剂盒(Takara)说明书，每个样本行3个副孔实验，以cDNA为模板，16 s RNA为内参，分析CagA、Ure表达水平，CagA引物为：正向5′-GGG CGT GTT TGA TGA GTC CT-3′，反向5′-TGT ATG TCG GTG GTG GTA GTG-3′，产物长度190 bp；Ure引物为：正向5′-AAC GGC TGG TGG TAT TGA C-3′，反向5′-TTC TTC TGC CTG GAG TGA TAG T-3′，产物长度为149 bp；16 s RNA引物为：正向5′-TGT GGG AGA GGT AGG TGG AA-3′，反向5′-CAT CGT TTA GGG CGT GGA CT-3′，产物长度为168 bp;应用Applied Biosystems 7000 Fast RT-PCR system，反应条件为：95 ℃ 30 s，预变性；95 ℃ 5 s，60 ℃ 31 s 40个循环，根据扩增曲线取溶解曲线单峰所得Ct值，并利用其△Ct值进行定量，得到处理组相对16s RNA PCR产物的浓度比值。

1.2.5 细菌总蛋白样本制备 收集含不同药物浓度的液体培养细菌及上清，真空冻干机(-60 ℃)隔夜处理后，使用RIPA裂解液(强)+ PMSF(100 mmol/L)混合试剂提取不同rhLF浓度处理的H.pylori总蛋白，经BCA试剂盒测定样本蛋白浓度，分装，-80 ℃保存。

1.2.6 Western blot 取75 μg总蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，10%分离胶 80 V 20 min，5%浓缩胶 100 V，60 min。100 mA 恒流转膜1 h，5%脱脂奶粉TBST封闭1 h，分别加入1∶3 000 CagA(Santa，sc-25766)、Ureα(Santa，sc-21016)、GAPDH(Thermo，GA1R)单抗，4 ℃孵育过夜，TBST洗3次(5、15、10 min)，分别加入对应的1∶5 000稀释的HRP标记二抗，室温孵育1 h，TBST洗3次(5、15、10 min)。取等量ECL发光液(Thermo，NCI4106)混匀，浸膜，曝光3～5 min，显影3 min，定影1 min，所得条带使用ImageJ软件分析各条带密度值，结果用目的蛋白/GAPDH密度值之比表示。

1.2.7 动物实验 取144只BABL/c小鼠分为4组，标准三联+rhLF组(A组)、rhLF组(B组)、标准三联组(C组)、生理盐水(D组)，H.pylori NCTC 11637灌胃建模，不同药物处理7 d后处死小鼠，行组织病理学苏木素-伊红(HE)染色观察胃黏膜炎性反应及ELISA法检测胃组织IL-8水平。

2 结 果

2.1 细菌鉴定 (1)菌落形态：平板上的H.pylori菌落肉眼可见圆形、扁平、半透明灰白色小菌落；(2)形态学检查：经革兰染色后，油镜下观察可见革兰阴性、S形、弧形或海鸥型，散在或成簇排列；(3)生化鉴定：快速Ure实验、触酶实验及氧化酶试验均阳性，可确认为H.pylori[14]。

2.2 rhLF对H.pylori生长抑制作用 本实验采用琼脂稀释法和脑心浸液液体法测定rhLF对H.pylori的MIC，结果显示其MIC均为0.5 mg/mL.

2.3 不同浓度rhLF及Fe3+对H.pylori生长的影响 本实验检测了不同浓度的rhLF对H.pylori生长增殖的影响，选取不同浓度的rhLF干预H.pylori生长，并以生理盐水作对照组，结果显示：rhLF抑制H.pylori生长繁殖呈现浓度依赖性，且进一步验证rhLF 0.5 mg/mL时H.pylori成完全抑制状态，见图1。同时加入不同浓度的Fe3+拮抗rhLF铁结合作用后显示：(1)培养基中加入25 μmol/L Fe3+后铁达到饱和；(2)在培养基中铁完全饱和的前提下，H.pylori生长仍未达到对照水平，与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01)，见图2。

图2 Fe3+及rhLF对H.pylori生长的影响

2.4 rhLF对CagA、Ure mRNA影响 采用不同浓度的rhLF干预细菌24 h，收集细菌菌体检测CagA、Ure mRNA的表达水平，以加生理盐水组为对照。结果显示：与对照组相比，不同浓度rhLF能抑制H.pylori CagA及Ure的表达(P<0.05)，图3。

A：CagA;B:Ure。

图3 rhLF对H.pylori CagA、Ure mRNA的影响

2.5 rhLF对H.pylori CagA、Ure蛋白的影响 采用不同浓度的rhLF干预细菌24 h，收集细菌菌体及培养上清液检测CagA、Ure 蛋白的表达水平，以加生理盐水组为对照。结果显示：与对照组相比rhLF能抑制H.pylori 毒力因子相关蛋白CagA及Ure的表达(P<0.05),见图4、5。

1：0.4 mg/mL rhLF组;2：0.3 mg/mL rhLF组;3：0.2 mg/mL rhLF组;4：对照组。

图4 rhLF对H.pylori CagA蛋白表达的影响

1：0.4 mg/mL rhLF组;2：0.3 mg/mL rhLF组;3：0.2 mg/mL rhLF组;4：对照组。

图5 rhLF对H.pylori Ure蛋白表达的影响

2.6 动物实验 与D组比较，A、B、C 3组炎症程度积分明显降低(P<0.05)；与B组比较，A、C组炎症积分明显降低(P<0.05)；与C组比较，A组炎症积分明显降低(P<0.05)，见图6；ELISA检测小鼠胃黏膜组织匀浆液中IL-8水平，结果见表1。

A:A组；B:B组；C:C组；D:D组。

图6 各组胃黏膜组织HE染色镜检形态学比较(×300)

a:P<0.05，与A组比较。

3 讨 论

H.pylori为慢性胃炎和十二指肠溃疡的主要致病因素，同时与胃溃疡关系密切。目前针对H.pylori的主要治疗为以抗菌药物为基础的标准三联或四联治疗方案[15-16]为主，随着根除治疗的普及和抗菌药物的广泛应用，H.pylori对抗菌药物耐药现象日益严重[17]，对抗菌药物的耐药成为根除失败的首要因素[18]。这也促使人们转换思维，从新的视角去审视H.pylori的治疗方案。rhLF是利用转基因技术获得的，既解决了来源问题，并能特异结合胃内人乳铁蛋白受体，更符合人体利用的分子特点。国外已有少许研究观察了牛乳铁蛋白抗H.pylori的作用，Dial等[19]的研究显示牛乳铁蛋白抗与H.pylori共培养，其浓度大于或等于0.5 mg/mL可抑制H.pylori的增殖，对人乳铁蛋白抗H.pylori的研究方面，Miehlke等[20]体外实验发现对13株临床分离菌株具有抑制作用。本研究观察到rhLF对H.pylori具有明显生长抑制作用，其MIC与Dial等[19]研究结果相符，结果显示rhLF对H.pylori抑制作用呈浓度依赖型作用效果。已有研究显示乳铁蛋白通过螯合Fe3+限制细菌生长所必需的金属离子[13]，此为其抗菌作用的基础，本实验观察了其抑菌作用是否仅为其铁结合能力所致，结果显示，在提供充足的铁以拮抗rhLF铁结合力后，H.pylori仍然受到不同程度的抑制，提示rhLF抗H.pylori作用为多种机制参与的结果。

本研究继续在CagA、Ure等H.pylori主要毒力因子形成的mRNA及蛋白表达水平上进一步论述了rhLF抗H.pylori的可能作用机制，结果显示，rhLF对菌体及其分泌的CagA、Ure mRNA和蛋白具有不同程度的抑制作用,从而可能减弱了H.pylori致病性。

体内实验结果显示，rhLF联合标准三联疗法可以降低小鼠胃黏膜HE染色炎症程度的积分，减轻胃黏膜炎性损伤程度，且减轻胃黏膜炎性损伤作用优于单独使用rhLF或标准三联疗法。H．pylori主要通过微生物Ⅳ型分泌系统(typesecretion system，TISS)将CagA基因编码的毒力蛋白过度表达与分泌，进而将大量嗜中性粒细胞趋化到胃黏膜部位，并导致炎性反应的加重[21]，注入胃黏膜上皮细胞中，并诱导胃上皮细胞IL-8 过度表达与分泌。本研究显示：rhLF可以降低IL-8在H.pylori感染的小鼠胃黏膜表面的水平，从而减轻胃黏膜炎性反应。

虽然本研究显示rhLF对H.pylori具有抑制生长、减弱致病性，同时保护胃黏膜、减轻炎性反应等特点，但其具体机制仍有待进一步研究。总之，其在治疗消化道疾病方面的价值值得开发研究。

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Experimental study on bacteriostatic effect of recombinant human lactoferrin on Helicobacter pylori*

LuoJuan1，ChengGuoxiang2,YuanYuping1，ZhangAiming2，LiuXuefang1，LiuSiguo2，BianLi3，ChenJianquan2，ZhangLei1，DongXiangqian1，YangGang1，NanQiong1，MaLanqing1△

(1.YunnanProvincialResearchInstituteofDigestiveDiseases/DepartmentofGastroenterology,FirstAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity,Kunming,Yunnan650032,China；2.JielongBioengineeringCo.,Ltd.,Shanghai200000,China; 3.DepartmentofPathology,FirstAffiliatedHospital,KunmingMedicalUniversity,Kunming,Yunnan650032,China)

Objective To evaluate the bacteriostatic effect of recombinant human lactoferrin(rhLF) on Helicobacter(H.) pylori and its influence on CagA,Ure and gastric mucosal IL-8.Methods The minimum inhibitory concentration(MIC)and the influence of different drug concentrations on the proliferation of H.pylori were detected.The effects of rhLF on the mRNA and protein expressions of CagA and Ure in H.pylori were detected by RT-PCR and Western blot,respectively.The animal study:Balb/c mice were adopted and assigned randomly into four groups，including the standard triple+rhLF(group A),rhLF(group B),standard triple(group C) and normal saline(group D).The histopathological HE staining was used to observe the gastric inflammation and ELISA was used to detect the IL-8 level of gastric tissue in each group.Results MIC was 0.5 mg/mL,moreover rhLF inhibited the bacterial growth and proliferation with a concentration-dependent manner.rhLF could reduce the expression of H.pylori major virulence factor CagA,mRNA and protein of Ure.Comparing the group A with the group B,C and D,the gastric mucosal inflammation score and the IL-8 levels of gastric tissue homogenates had statistically significant differences(P<0.05).Conclusion rhLF inhibits the growth and proliferation of H.pylori,moreover inhibit the expression of major virulence factor CagA in H.pylori,mRNA and protein of Ure in different degrees,weakens its pathogenicity,meanwhile reduces the IL-8 level in mice gastric mucosa,and alleviates H.pylori related gastric mucosal inflammatory response.

helicobacter pylori；lactoferrin;cytotoxin associated gene A；urease；interleukin-8

云南省联合专项基金资助项目(2012FB027)。

罗娟(1985-)，主治医师，硕士，主要从事消化内科基础和临床研究。
△

，E-mail:malanqing@aliyun.com。。

� 著·

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.10.002

R573

A

1671-8348(2016)10-1302-04

2015-12-18

2016-01-25)