淫羊藿甙诱导人骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化实验研究

黄荷，曾意荣，简林养

1.广州市中西医结合医院，广东 广州 510800；2.广州中医药大学第一附属医院，广东 广州 510405

◆实验研究论著◆

淫羊藿甙诱导人骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化实验研究

黄荷1，曾意荣2，简林养1

1.广州市中西医结合医院，广东 广州 510800；2.广州中医药大学第一附属医院，广东 广州 510405

目的：观察淫羊藿甙对人骨髓间充质干细胞（hMSCs）向软骨细胞诱导分化的作用。方法：骨髓样本取自广州中医药大学第一附属医院关节一科因骨关节炎行全髋关节置换手术的病人，用含有1mL肝素（100 U/mL）的注射器抽取骨髓5 mL，并立即送入实验室进行体外培养。收集体外增殖培养第3代的细胞，分5组：未诱导组、对照组、淫羊藿甙低剂量组、淫羊藿甙中剂量组、淫羊藿甙高剂量组。置于细胞培养箱培养，隔天换液1次，培养21天。甲苯胺蓝染色及SABC免疫组化法检测软骨细胞，并定量测定胶原α1mRNA表达水平。结果：甲苯胺蓝染色鉴定：淫羊藿甙高剂量组和对照组染色均可见胞浆成紫红色质，表明糖氨聚糖含量丰富，hMSCs向软骨细胞分化；淫羊藿甙低、中剂量组及未诱导组染色未见特征性紫红色异染，表明hMSCs未见明显软骨分化。Ⅱ型胶原SABC免疫组化法鉴定：淫羊藿甙高剂量组和对照组免疫组化染色后可见棕黄色胶原颗粒，淫羊藿甙高剂量组最为密集，表明Ⅱ型胶原含量多，hMSCs向软骨细胞分化显著；淫羊藿甙低、中剂量组见少量棕黄色胶原；未诱导组未见胶原染色。从荧光定量PCR检测结果分析，淫羊藿甙高剂量组、对照组Ⅱ型胶原相对表达量较高，2组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。淫羊藿甙低、中剂量组Ⅱ型胶原相对表达量较低，2组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。未诱导组无胶原表达。结论：淫羊藿甙可在体外诱导hMSCs分化为软骨细胞。

淫羊藿甙；骨髓间充质干细胞；软骨细胞；分化；诱导

骨髓间充质干细胞(BMSCs)是一群具有多向分化潜能的均质性细胞，作为种子细胞能够根据微环境信号的指令分别分化为成骨细胞和软骨细胞，适合于伴随软骨下骨损伤的软骨缺损修复。从骨代谢进行研究发现，BMSCs的生物学特性与中医理论“肾主骨生髓”存在相关性。骨、软骨的生长、修复均依赖于肾中精气所提供的濡养和推动。以往多以动物来源的BMSCs作为研究对象，本实验拟研究补肾中药淫羊藿的有效活性单体成分淫羊藿甙对人骨髓间充质干细胞(hMSCs)向软骨细胞的诱导分化的作用，结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 骨髓样本取自广州中医药大学第一附属医院关节一科因骨关节炎行全髋关节置换手术的患者，经医院医学伦理委员会IRB允许并征得患者知情同意，从病人股骨近端髓腔中抽取获得。用含有1 mL肝素(100 U/mL)的注射器抽取骨髓5 mL，并立即送入实验室进行体外培养。

1.2 主要试剂 MEM培养基(美国Gibco公司)；胎牛血清(美国Hyclone公司)；胰酶(北京索莱宝生物公司)；转化生长因子β(TGF-β，美国Peprotech公司)；维生素C(上海江莱生物科技有限公司)；地塞米松(上海晶天生物科技有限公司)；胰岛素-转铁蛋白-硒酸钠(美国Sigma公司)；小鼠抗人胶原蛋白Ⅱ单抗(Santa公司)；PE标记二抗小鼠 IgG(美国BioLegend)；RNA提取试剂盒(北京TIANGEN公司)；DNA聚合酶(北京TIANGEN公司)；NTP mix(北京TIANGEN公司)；引物合成(大连TaKaRa公司)；探针合成(大连TaKaRa公司)；磷酸缓冲盐溶液1×PBS(pH=7.4)(北京索莱宝生物)；双抗(美国Gibco公司)。

1.3 主要仪器 75 cm2培养瓶，25 cm2培养瓶；50 mL离心管，15 mL离心管(美国Corning公司)；24孔培养板(丹麦Nunc公司)；25 mL移液管，10 mL移液管，5 mL移液管，2 mL移液管(美国Corning公司)；6孔板(Coning)；酶标仪，CO2培养箱(Heraeus)；针头滤器，0.22 μm滤膜(MILLIpore)；SIGMA-3K15离心机(sigma)。免疫荧光纤维镜(日本奥林巴斯公司)；Real-time PCR(美国ABI公司)，倒置显微镜(日本奥林巴斯公司)。

1.4 细胞分组及处理 收集体外增殖培养第3代的细胞，分5组：未诱导组，hMSCs不加诱导剂继续培养；对照组，加入诱导液(TGF-β10 μg/L、Dex0.1 μmol/L、VitC50 mg/L)；淫羊藿甙低剂量组，在含10%FBS H-DMEM培养基中加入淫羊藿甙(终浓度为20 μg/L)；淫羊藿甙中剂量组，在含10% FBS H-DMEM培养基中加入淫羊藿甙(终浓度为40 μg/L)；淫羊藿甙高剂量组，在含10%FBS H-DMEM培养基中加入淫羊藿甙(终浓度为60 μg/L)。置于细胞培养箱培养，隔天换液1次，培养21天。

1.5 软骨细胞鉴定 ①甲苯胺蓝染色：甲苯胺蓝染色显示软骨细胞周围异染性。糖氨聚糖用甲苯胺蓝等碱性染料染色后呈紫红色，而不是蓝色，这种染色现象称为异染性(metachromasia)基质。②SABC免疫组化法：胞浆Ⅱ型胶原免疫着色为棕黄色。以4%多聚甲醛固定20 min，并灭活内源性过氧化物酶，5%BSA室温封闭20 min。滴加1∶100的兔抗胶原Ⅱ一抗，4℃过夜，阴性对照以PBS代替一抗。PBS洗涤2 min×3次。滴加生物素化山羊抗兔IgG，37℃恒温箱20 min，PBS洗涤5 min×4次。二氨基联苯胺(DAB)显色8 min，蒸馏水洗涤，苏木素轻度复染10 s，充分水洗。梯度酒精脱水，二甲苯透明，封片。③胶原α1 mRNA表达水平定量测定。用Trizol试剂裂解沉淀细胞后，提取总mRNA，按逆转录试剂盒操作步骤进行逆转录，得到cDNA。在PE7700荧光定量PCR仪上定量检测胶原α1mRNA表达水平。反应体系为：ddH2O 10.105mL，cDNA 1 mL，2×SYBR Green QPCR master mix 12.5 mL，ROX passive reference 0.375 mL，Forward primer(10 mmol/L)0.5 mL， Reverse primer (10mmol/L)0.5 mL，probe(10 mmol/L)0.2 mL，总体积25 mL。Ⅱ型胶原α1反应条件为：95℃预变性10 min，95℃2 min，60℃30 s，72℃1.5 min，共40个循环；循环结束后继续进行建立熔解曲线的反应，最后用专用软件自动分析结果。

2 结果

2.1 各组软骨细胞鉴定结果比较 见图1、图2。甲苯胺蓝染色鉴定：淫羊甙藿高剂量组和对照组染色均可见胞浆成紫红色质，表明糖氨聚糖含量丰富，hMSCs软骨细胞分化；淫羊藿甙低、中剂量组及未诱导组染色未见特征性紫红色异染，表明hMSCs未见明显软骨分化。Ⅱ型胶原SABC免疫组化法鉴定：淫羊藿甙高剂量组和对照组免疫组化染色后可见棕黄色胶原颗粒，淫羊藿甙高剂量组最为密集，表明Ⅱ型胶原含量多，hMSCs软骨细胞分化显著；淫羊藿甙低、中剂量组见少量棕黄色胶原；未诱导组未见胶原染色。

图1 高剂量淫羊藿甙组甲苯胺蓝染色结果（×40）

图2 高剂量淫羊藿甙组Ⅱ型胶原SABC免疫组化法鉴定（×40）

2.2 各组胶原mRNA定量结果比较 见表1。从荧光定量PCR检测结果分析，淫羊藿甙高剂量组、对照组Ⅱ型胶原相对表达量较高，2组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。淫羊藿甙低、中剂量组Ⅱ型胶原相对表达量较低，2组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。未诱导组无胶原表达。

表1 各组胶原蛋白mRNA定量结果比较()

表1 各组胶原蛋白mRNA定量结果比较()

淫羊藿甙低剂量组淫羊藿甙中剂量组淫羊藿甙高剂量组原Ⅱ检出1 . 2 2 7 . 5 7 ± 2 . 3 4 7 . 0 5 ± 3 . 3 8 2 . 6 3 ± 1 . 2 9 1 8 S 2 . 5 4 ± 2 . 0 6 6 . 0 1 ± 2 . 1 3 6 . 6 2 ± 2 . 6 4 5 . 5 8 ± 3 . 5 5 6 . 0 1 ± 2 . 3 4 Δ Δ C t -3 . 1 8 ± 1 . 1 1 0 . 9 5 ± 0 . 8 8 1 . 4 7 ± 0 . 2 3 -3 . 3 8 ± 1 . 2 4 2 -ΔΔCt9 . 0 6 ± 5 . 4 6 0 . 5 1 ± 0 . 3 3 0 . 3 6 ± 0 . 5 4 1 0 . 4 1 ± 4 . 7 8基因C t值

3 讨论

骨关节炎的病理学特点是以严重的局限性软骨破坏，深达骨质为特点。如何修复受损的关节软骨并保持其功能，是骨关节炎的治疗目标。而临床上软骨缺损的治疗一直是个难题，主要是因为软骨自身修复能力弱，甚至不存在。而应用软骨细胞移植修复也不能成功，原因主要是由于软骨细胞几乎没有迁移能力，不能迅速聚集到创伤部位。而BMSCs具有强大的增殖能力、多向分化能力及低免疫原性，贴壁生长特性等等，而这些特性正可以使BMSCs成为种子细胞来修复软骨缺损。因此，对软骨缺损的修复转向干细胞诱导分化成软骨细胞研究。

软骨细胞占关节软骨总容量的1%左右，它的功能是合成分泌并维持外基质。关节软骨的正常生理功能依赖于软骨细胞和细胞外基质的代谢平衡。细胞外基质主要由组织液、胶原、蛋白聚糖、非胶原蛋白等组成[1]。其中胶原纤维是软骨的基本框架，胶原纤维占成人关节软骨干重的2/3，而Ⅱ型胶原占胶原总数的80%～90%，由3条α1链以螺旋方式组成[2]。Ⅱ型胶原是关节软骨的重要组成成分，对维持关节软骨的弹性及硬度具有重要作用。在骨关节炎的发病过程中最主要的特点是关节软骨的进行性丢失[3]，Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的破坏最为显著，影响了关节软骨的正常生理功能。有研究表明，以猪Ⅱ型胶原移植修复新西兰大白兔的关节软骨缺损，收到良好效果[4]。而最理想的软骨修复是建立软骨细胞与Ⅱ型胶原的合成分解代谢平衡体系，这样才能获得持久的效果。本研究通过中药单体淫羊藿甙诱导BMSCs向软骨细胞分化，甲苯胺蓝染色阳性，Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性均提示诱导细胞表达特异性细胞基质，这两者是软骨细胞的特征性标志，说明诱导细胞具有软骨细胞的特点。本实验结果提示，淫羊藿甙可在体外诱导hMSCs分化为软骨细胞，为今后临床应用hMSCs修复软骨的治疗提供了细胞分子生物学水平的初步依据。

中药的体外药理实验因中药本身的特点实施困难。目前常采用的方法是“含药血清”实验方法。所谓“含药血清”，是指给动物或人服用一定量的药物后，经过一定的时间采血所获得的血清，以模拟并试图替代药物本身而供实验研究使用的一种非单体药物药理研究的方法。近年来，该方法开始引起众多研究者的重视，并做了广泛的研究，有效地带动了中药及复方体外药效学及药理学评价研究的发展，但也逐渐暴露出其自身无法克服的弊端：无法确定最佳给药方案；无法做到体外培养体系内药物浓度与血药浓度相等又不影响组织、细胞生长；药效最佳的采血时间难以确定；血清成分复杂，不可控的影响因素太多，实验结果重复性差；血清本身固有的活性成分常影响试验结果，缺乏去除血清影响的理想措施[5]。而中药单体成分简单，避免了中药制剂中的多种杂质，电解质以及不同的酸碱度对体外培养系的影响，提高了研究结果的可靠性，从而对中药进行细胞学水平研究具有可行性。

淫羊藿始载于《神农本草经》。其味辛甘，性温，入肝肾二经，具有补肾壮阳，祛风除温等功效。用于阳萎遗精、筋骨痿软、风湿痹痛、麻木拘挛等。现代化学研究表明，淫羊藿单体成分淫羊藿甙为主要有效成分，具有广泛药理作用，可补肾阳，强筋骨[6]。药理学试验表明，其对于去卵巢肾阳虚造模的大鼠骨质疏松具有明显的药理作用[7]。

BMSCs体外向软骨细胞分化受诸多生物学因素的影响，包括细胞培养微环境，细胞因子的参与、药物等等。目前诱导BMSCs向软骨细胞分化常用的诱导剂多由TGF-β、胰岛素，地塞米松等组成[8]。近来实验发现，以中药制剂作为诱导剂也取得成功[9～10]。本组实验研究发现，含10%FBS H-DMEM培养基中加入淫羊藿甙能诱导BMSCs向软骨细胞分化，荧光定量PCR可以检测到Ⅱ型胶原表达。淫羊藿甙高剂量组诱导BMSCs软骨细胞分化显著。中医学认为，“肾主骨”“肾藏精，精生髓，髓养骨，骨生髓”，现代医学已经证实，补肾之法可以治疗骨质疏松、关节软骨退行性变。高剂量的淫羊藿甙有较强的补肾阳，强筋骨的功效，这种治疗作用与诱导BMSCs成软骨细胞分化的机制可能有内在的相关性。

［参与文献］

[1] Huber M，Trattnig S，Lintner F.Anatomy，biochemistry， and physiology of articular cartilage[J].Invest Radiol，2000，35(10)：573-580.

[2]Eyre DR，Wu JJ.Collagen structure and cartilage matrix integrity[J].J Rheumatol，1995，43(Suppl)：82-85.

[3] Kim HA，Blanco FJ.Cell death and apoptosis in osteoarthritic cartilage[J].Curr Drug Targets，2007，8(2)：333-345.

[4]李斯明，黄雪芳，叶惠贞，等.Ⅱ型胶原移植修复关节软骨缺损过程中抗体水平的动态变化[J].中国风湿病学杂志，2004，8(6)：332-334.

[5]张红敏，谢春光，陈世伟.含药血清体外药理试验的评价[J].中国中西医结合杂志，2004，24(8)：741-745.

[6]梅全喜，毕焕新.现代中药药理手册[M].北京：中国中医药出版社，1998，10：554.

[7]解芳，张岩，吴春福，等.淫羊藿提取物对去卵巢大鼠骨转换率增强的抑制作用[J].中草药，2005，11(36)：1667-1670.

[8] Li WJ，Richard T，Huang XX，et al.Multilineage differentiation of human mesenchymal stem cells in a three-dimensional nanofibrous scaffold[J].Biomaterials，2005，26(25)：5158-5166.

[9]吴追乐，刘献祥，李西海，等.透骨消痛颗粒诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞的分化[J].中国组织工程研究与临床康复，2009，13(33)：6456-6460.

[10]汤治黎，章汉平，李源，等.丹参注射液诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞的研究[J].湖北中医杂志，2008，30(6)：11-12.

（责任编辑：骆欢欢）

R285.5

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0256-7415（2016）01-0210-03

10.13457/j.cnki.jncm.2016.01.095

2015-06-11

广州市花都区科技计划项目（12-HDWS041）

黄荷（1974-），男，副主任中医师，研究方向：骨关节疾病的中西医结合治疗。