纳米Al2O3固定化红平红球菌菌球的制备及其对苯酚的降解

向海弘，何慧军，杨春平，3，程 燕，张 毅，杨伟强

（1. 湖南大学 环境科学与工程学院，湖南 长沙 410082；2. 湖南大学 环境生物与控制教育部重点实验室，湖南 长沙 410082）

纳米Al2O3固定化红平红球菌菌球的制备及其对苯酚的降解

向海弘1，2，何慧军1，2，杨春平1，2，3，程 燕1，2，张 毅1，2，杨伟强1，2

（1. 湖南大学 环境科学与工程学院，湖南 长沙 410082；2. 湖南大学 环境生物与控制教育部重点实验室，湖南 长沙 410082）

以海藻酸铝为主要包埋材料、纳米Al2O3为添加剂，包埋固定红平红球菌，制得纳米Al2O3固定化红平红球菌菌球，并将其用于苯酚的降解。表征结果显示：菌球内部包含丰富的菌丝体；内部孔径以中孔居多。实验结果表明：菌球的最优制备方案为0.05 g纳米Al2O3加入3 mL海藻酸钠溶液中、海藻酸钠质量分数6%、微生物包埋量0.5 mL/mL（以海藻酸钠溶液计）、Al2（SO4）3质量分数3%；在初始苯酚质量浓度为400 mg/L、反应时间为24 h、菌球加入量为8 g/L、反应pH为8.0、反应温度为30 ℃的条件下，菌球首次使用时可使苯酚完全降解，使用5次后的苯酚降解率仍达93%以上，具有良好的循环使用性。

纳米Al2O3；固定化；红平红球菌；苯酚；降解

苯酚属高毒类化合物，人体摄入一定量后会出现急性中毒反应，长期饮用被苯酚污染的水体可引发瘙痒、贫血、头晕及神经系统障碍。苯酚污染主要来源于煤气、炼油、焦化、木材防腐、化工等行业排放的废水［1］。针对苯酚废水，国内外学者总结出了4大类治理方法：化学法、高级氧化法、物化法和生物法［2-5］。应用固定化微生物技术对苯酚废水进行治理，具有稳定性强、处理效率高、无二次污染等优点，是目前的重点研究方向［6-10］。

在固定化微生物技术的研究中，选择具有良好性能的载体是其中最为重要的课题之一［11-13］。纳米复合材料由于具有良好的理化性质、特殊的纳米效应及生物相容性，成为一种理想载体［14］。纳米Al2O3具有高比表面积和高表面能，将其加入包埋材料中可有效促进微生物对污染物的降解［15-16］。在微生物方面，红平红球菌（Rhodococcus erythropolis）属红球菌，可转化降解多种难降解有机物［17-21］。

本工作以海藻酸铝为主要包埋材料、纳米Al2O3为添加剂，包埋固定红平红球菌，制得纳米Al2O3固定化红平红球菌菌球（简称纳米Al2O3固定化菌球），并将其用于苯酚的降解。利用正交实验对纳米Al2O3固定化菌球的制备工艺进行了优化，并考察了苯酚降解效果的影响因素，以期为工业应用提供参考。

1 实验部分

1.1 试剂、材料和仪器

纳米Al2O3：纯度99.99%，粉末状，阿拉丁试剂（上海）有限公司；苯酚、海藻酸钠（SA）、CaCl2、Al2（SO4）3、NaOH、HNO3：分析纯。

红平红球菌：购于中国典型微生物保藏中心，菌种保藏号为ACCC No. 10543。

基础培养基［22］（用于菌种的富集与活化）：酵母浸出粉5 g，胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，蒸馏水1 000 mL，pH=7.0。斜面培养基和固体平板在上述配方基础上加入质量分数为2%的琼脂。

无机盐培养基（用于降解实验）：NH4Cl 2 g，MgSO40.2 g，K2HPO40.5 g，KHPO40.2 g，FeCl30.005 g，CaCl20.001 g，蒸馏水1 000 mL，pH=7.0。

实验中所使用的培养基均经121 ℃高温蒸汽灭菌锅灭菌20 min。

DHG-9076A型电热恒温鼓风干燥箱：上海玺恒实业有限公司；ZDX-35B型座式自控电热压力蒸汽灭菌锅：上海精密仪器仪表有限公司；LRH-250A型生化培养箱：上海齐欣科学仪器有限公司；THZ-82B型气浴恒温振荡器：常州诺基仪器有限公司；Mili-q型超纯水机：密理博中国有限公司；NOVA-2000e型比表面积测定仪：美国Quantachrome公司；QUANTA-200型环境扫描电子显微镜：荷兰Philips-FEI公司；722型可见光分光光度计：上海菁华科技仪器有限公司；FE-20型pH计：上海精密仪器仪表有限公司； WGZ-20型浊度计：美国Biolog公司；AL-104型分析天平：梅特勒-托利多国际股份有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 纳米Al2O3固定化菌球的制备

称取0.05～0.15 g纳米Al2O3粉末，将其加入到3 mL质量分数为2%～6%的海藻酸钠溶液中，搅拌均匀，得到无菌纳米Al2O3和海藻酸钠混合液。向上述混合液中接种0.5～1.5 mL菌浓度为2.0×106个/mL的红平红球菌悬浮液，充分混合后逐滴滴入60 mL浓度为0.8 mol/L的无菌CaCl2溶液中，交联30 min，得到纳米Al2O3-海藻酸钙-红平红球菌微球。用无菌超纯水将上述微球洗涤3次，置于30 mL质量分数为1%～3%的Al2（SO4）3溶液中固定4 h。将微球滤出，用无菌超纯水洗涤3次，得到纳米Al2O3-海藻酸铝-红平红球菌微球。将纳米Al2O3-海藻酸铝-红平红球菌微球转移至100 mL的基础培养基中，在温度30 ℃、摇床转速120 r/min的条件下恒温振荡培养24 h后，将菌球滤出，即得最终的纳米Al2O3固定化菌球。

采用正交实验对制备条件进行优化。不加入纳米Al2O3粉末，在最优条件下重复上述操作，制得未加纳米Al2O3的菌球。

1.2.2 苯酚的降解实验

在无机盐培养基中加入一定量的苯酚，取该培养基100 mL置于250 mL锥形瓶中，并加入一定量最优条件下制备的纳米Al2O3固定化菌球。用0.1 mol/L的HNO3或NaOH溶液调节pH，在摇床转速120 r/min的条件下恒温振荡一定时间。每隔一段时间取样。

1.3 分析方法

采用4-氨基安替吡啉直接光度法［23］测定所取试样中的苯酚含量，计算苯酚降解率。采用浊度计测定菌浓度。采用SEM技术观察菌球的微观形貌。采用BET技术分析纳米Al2O3固定化菌球的孔结构。

2 结果与讨论

2.1 正交实验结果

在制备纳米Al2O3固定化菌球的过程中，纳米Al2O3加入量、SA质量分数、菌液接种量（即微生物包埋量）、Al2（SO4）3质量分数会影响菌球对苯酚的降解效果。在前期实验确定上述4因素取值范围的基础上，以苯酚降解率为主要考核指标，采用4因素3水平进行正交实验，正交实验因素水平见表1，正交实验结果见表2。由表1和表2可见：理论最优方案为A1B3C3D3，即纳米Al2O3加入量0.05 g、SA质量分数6%、微生物包埋量1.5 mL、Al2（SO4）3质量分数3%；此方案对应的苯酚降解率最高，成球性最好；各因素对苯酚降解率影响的大小顺序为：D＞C＞A＞B，即Al2（SO4）3质量分数＞微生物包埋量＞纳米Al2O3加入量＞SA质量分数。

表1 正交实验因素水平

表2 正交实验结果

2.2 菌球的表征结果

2.2.1 SEM照片

菌球的SEM照片见图1。由图1可见：未加纳米Al2O3菌球的横截面上有零散分布的菌丝体；而加入纳米Al2O3后，可明显观察到红平红球菌的长势良好，大量的菌丝体被包埋在微球内部，附着生长。由此可推知，纳米Al2O3固定化后的红平红球菌微球具有特殊的结构，纳米Al2O3能为微生物吸附固定在其表面提供足够大的空间，优化了红平红球菌在菌球内的生长，从而提高其对苯酚的降解率。

图1 菌球的SEM照片

2.2.2 BET数据

经测定，最优条件下制备的纳米Al2O3固定化菌球的比表面积为2.294 m2/g，总孔体积为1.664×10-2cm3/g。纳米Al2O3固定化菌球的孔径分布见图2。由图2可见，纳米Al2O3固定化菌球的内部孔径集中在30 nm以下，中孔居多。这有利于红平红球菌包埋于孔中，同时也能确保微生物所需营养元素及目标污染物进入菌球内，便于红平红球菌接触吸收。

图2 纳米Al2O3固定化菌球的孔径分布

2.3 苯酚降解效果的影响因素

2.3.1 反应时间和初始苯酚质量浓度

在纳米Al2O3固定化菌球加入量为8 g/L、反应pH为8.0、反应温度为30 ℃的条件下，反应时间和初始苯酚质量浓度对苯酚降解效果的影响见图3。由图3可见：随初始苯酚质量浓度的增加，苯酚的完全降解需要更长的时间；当初始苯酚质量浓度为100，200，400 mg/L时，苯酚完全降解的时间分别为16，18，24 h；当初始苯酚质量浓度增至600 mg/ L时，24 h后的苯酚质量浓度降至418 mg/L，表明纳米Al2O3固定化菌球仍具有一定的降解能力。

图3 反应时间和初始苯酚质量浓度对苯酚降解效果的影响

2.3.2 纳米Al2O3固定化菌球加入量

在初始苯酚质量浓度为400 mg/L、反应时间为22 h、反应pH为8.0、反应温度为30 ℃的条件下，纳米Al2O3固定化菌球加入量对苯酚降解率的影响见图4。由图4可见：当菌球加入量从2 g/L增至6 g/ L时，苯酚降解率从43.6%提高到78.6%；当菌球加入量为8 g/L时，苯酚降解率达到94.8%的最大值；再增加菌球加入量，苯酚降解率反而下降。这是因为当菌球加入量过大时，会引起菌体生长过快，导致单位体积内的营养和溶解氧供应不足，不利于对苯酚的降解。因此，选择最适菌球加入量为8 g/L。

图4 纳米Al2O3固定化菌球加入量对苯酚降解率的影响

2.3.3 反应pH

pH对微生物的生命活动有很大的影响。在初始苯酚质量浓度为400 mg/L、反应时间为22 h、菌球加入量为8 g/L、反应温度为30 ℃的条件下，以未加纳米Al2O3的菌球作为对照组，反应pH对苯酚降解率的影响见图5。由图5可见：实验组的苯酚降解率相对于对照组在不同pH下均有较大程度地提高；在pH为4.0或10.0（即过酸或过碱）的条件下，实验组的苯酚降解率较低，均低于70%；在pH 为5.0～9.0的范围内，苯酚降解率较高；当pH为8.0时，实验组的苯酚降解率达到最大，为94.8%。这是因为：苯酚降解过程中产生的物质多数呈酸性，使培养基中的pH降低［25］；当初始pH为8.0时，伴随着实验的进行pH趋于中性，有利于微生物对苯酚的降解；这使得红平红球菌在微碱性溶液中具有很好的苯酚降解率。因此，选择最适反应pH为8.0。

图5 反应pH对苯酚降解率的影响

2.3.4 反应温度

在初始苯酚质量浓度为400 mg/L、反应时间为22 h、菌球加入量为8 g/L、反应pH为8.0的条件下，以未加纳米Al2O3的菌球作为对照组，反应温度对苯酚降解率的影响见图6。由图6可见：在相同的温度环境下进行苯酚降解，实验组相对于对照组表现出较为明显的优势；在30～35 ℃的温度范围内，实验组的苯酚降解率达到90%以上，明显高于其他温度范围；反应温度为30 ℃时的苯酚降解率最高。由此可见，环境温度过低或过高均会抑制苯酚降解菌酶的活性，从而抑制苯酚的生物降解［26］。因此，选择最适反应温度为30 ℃。

图6 反应温度对苯酚降解率的影响

2.4 纳米Al2O3固定化菌球的重复使用效果

在实际工业应用中往往会涉及到固定化菌球的多次重复使用。在初始苯酚质量浓度为400 mg/ L、反应时间为24 h、菌球加入量为8 g/L、反应pH 为8.0、反应温度为30 ℃的条件下，纳米Al2O3固定化菌球的重复使用效果见图7。由图7可见：在菌球的5次重复使用过程中，第1和第2次的苯酚降解率维持在100%，第3～5次的苯酚降解率出现不同程度的下降，但下降幅度较小；使用5次后的苯酚降解率仍达93%以上，说明纳米Al2O3固定化菌球在循环使用过程中保持着稳定的生物活性，具有良好的重复使用性。

图7 纳米Al2O3固定化菌球的重复使用效果

3 结论

a）纳米Al2O3固定化菌球的最优制备方案为纳米Al2O3加入量0.05 g、SA质量分数6%、微生物包埋量1.5 mL、Al2（SO4）3质量分数3%。

b）表征结果显示：纳米Al2O3固定化菌球内部包含丰富的红平红球菌菌丝体；菌球具有较大的比表面积，内部孔径集中在30 nm以下，中孔居多。

c）纳米Al2O3固定化菌球降解苯酚的最适条件为菌球加入量8 g/L、反应pH 8.0、反应温度30 ℃。

d）在初始苯酚质量浓度为400 mg/L、反应时间为24 h、菌球加入量为8 g/L、反应pH为8.0、反应温度为30 ℃的条件下，纳米Al2O3固定化菌球首次使用时可使苯酚完全降解，使用5次后的苯酚降解率仍达93%以上，具有良好的重复使用性。

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（编辑 魏京华）

Preparation of Rhodococcus erythropolis beads immobilized with nano Al2O3and degradation of phenol

Xiang Haihong1，2，He Huijun1，2，Yang Chunping1，2，3，Cheng Yan1，2，Zhang Yi1，2，Yang Weiqiang1，2

（1. College of Environmental Science and Engineering，Hunan University，Changsha Hunan 410082，China；2. Key Laboratory of Environmental Biology and Pollution Control，Ministry of Education，Hunan University，Changsha Hunan 410082，China）

The bacterial beads of immobilized Rhodococcus erythropolis with nano Al2O3was prepared by embedding method using sodium aluminum as major embedding materials and nano Al2O3as additives. The bacterial beads were used for degradation of phenol. The characterization results show that the beads contain abundant mycelium inside and the majority of the internal holes are mesoporous. The optimum conditions for preparation of the beads are as follows：adding 0.05 g nano Al2O3into 3 mL sodium alginate solution，sodium alginate mass fraction 6%，microorganism embedding capacity 0.5 mL for 1 mL sodium alginate solution and Al2（SO4）3mass fraction 3%. Under the conditions of initial phenol mass concentration 400 mg/L，reaction time 24 h，bacterial beads dosage 8 g/L，reaction pH 8.0 and reaction temperature 30 ℃，phenol is completely degraded at the fi rst use of bacterial beads，and the phenol degradation rate maintains higher than 93% after 5 times of reuse，which indicate that the beads are reusable.

nano Al2O3；immobilization；Rhodococcus erythropolis；phenol；degradation

X703

A

1006-1878（2016）03-0272-06

10.3969/j.issn.1006-1878.2016.03.007

2015 - 11 - 20；

2016 - 02 - 28。

向海弘（1992—），女，湖南省邵阳市人，硕士生，电话 15074968068，电邮 x09438106@163.com。联系人：杨春平，电话 0731 - 88823987，电邮 yangc@hnu.edu.cn。

国家国际科技合作专项（2015DFG92750）；湖南省战略性新兴产业科技攻关类项目（2014GK1012）。