HPV-16多肽在前列腺癌患者血清抗体筛查中的应用

周政 孙玉峰 郭帅 浦金贤 赵晓俊

·实验研究·

HPV-16多肽在前列腺癌患者血清抗体筛查中的应用

周政 孙玉峰 郭帅 浦金贤 赵晓俊

目的探讨HPV-16感染与前列腺癌的相关性及基于HPV-16多肽微阵列芯片在前列腺癌患者血清筛查中的应用。方法对来自HPV-16病毒的7个蛋白的胞外段序列进行叠瓦式切割，构建基于241条精细多肽库的微阵列芯片，对经病理确诊的72例前列腺癌患者和87例前列腺增生患者行血清学筛查。用微阵列芯片表达差异显著分析法筛选在前列腺癌患者和前列腺增生患者血清中具有差异性表达的多肽(特异性多肽)；以受试者工作特征曲线(receiver operator characteristic curve, ROC)评价这些多肽对前列腺癌的诊断价值，并与PSA相比较。结果HPV-16多肽在两组血清中的抗体响应不同，与HPV-16多肽反应的自身抗体既存在于前列腺癌患者中，也存在于前列腺增生患者中。其中存在15条多肽，与之响应的抗体在两组血清中呈差异性表达；对这15条具有潜在诊断价值的多肽进行ROC曲线分析，发现多指标联合的诊断模型具有更高的诊断效率，由15条多肽构成的多指标联合诊断模型ROC曲线下面积为0.772，在最佳临界值的诊断灵敏度为75.3%，特异度为61.8%；PSA的ROC曲线下面积为0.770，在最佳临界值的诊断灵敏度为65.3%，特异度83.9%。结论前列腺癌患者血清中存在HPV-16特异性自身抗体，并可通过HPV-16多肽微阵列技术加以检测。

前列腺癌； HPV-16； 多肽微阵列

前列腺癌是男性泌尿系统最常见的恶性肿瘤。关于前列腺癌的发生、发展机制目前尚未完全明了。在过去的几十年间，有大批的实验报道称前列腺癌与性活动有关，是性传播感染导致的疾病[1-3]。更有大量流行病学研究表明，多种病毒在前列腺癌进展中具有致癌潜力，例如人乳头瘤病毒(HPV)、多瘤病毒(SV40)和疱疹病毒家族的成员[4]。其中HPV-16是最常见的高危HPV类型之一，有研究表明以基因检测法和血清学筛查法证实HPV-16感染存在于前列腺癌患者之中[3，5]。然而HPV感染与前列腺癌的关系仍处于研究之中。

过去几十年中，微阵列的技术发展迅速，已成为大规模和高通量生物学研究的关键工具，开创了信息收集和分析的新时代。本研究使用一种新型的固体支撑材料—改性聚二甲基硅氧烷(integrated polydimethylsiloxane，iPDMS)，它能够有效地固定多肽并保持其生物活性，从而满足体外诊断的要求[6]。基于以上背景，本实验拟采用基于iPDMS的多肽微阵列技术进行研究，并配合生物信息学手段进行分析，旨在发现前列腺癌和前列腺增生患者血清中HPV-16相关抗体表达水平的差异，并进一步评估该方法对前列腺癌的诊断价值。

材料与方法

一、研究对象

本实验选取2014年9月至2016年1月苏州大学附属第一医院收治的159例经B超引导前列腺穿刺活检的患者，其中病理确诊为前列腺癌患者72例，中位年龄71岁(66.7～72.7岁)；病理确诊为前列腺增生患者87例，中位年龄64岁(58.0～70.0岁)，患者临床资料见表1。患者血清均采自穿刺前1天清晨空腹静脉血，室温下静置1 h后3 000 r/min 离心10 min，将血清分装后置于-80 ℃冰箱保存备用。患者均知情同意。

表1 前列腺癌和前列腺增生患者的临床病理特征

二、多肽的合成及多肽芯片的制备

从NCBI数据库获得的HPV-16的7个功能蛋白(E1、E2、E4、E6、E7、L1和L2)及对应氨基酸序列信息，并对其进行叠瓦式切割，每条多肽含20个氨基酸(amino acid, aa)，相邻的两条多肽位移10aa，由此，共获得241条多肽，以HPV-001至HPV-241命名。将iPDMS置于活化液中使表面的羧基基团充分活化，便于与多肽的氨基端或是氨基酸侧链的氨基基团结合形成肽键而将多肽固定于iPDMS表面。使用晶芯SmartArrayer 48微阵列芯片点样仪进行点样，点样阵列设计为9×9×6形式，每一张芯片都由4个子阵列组成，子阵列的四角为人源IgG(阳性对照点)，四边为PB点(阴性对照点)，中央区为多肽区，点样完成后静置过夜固定。使用电视显微镜检验制备好的芯片，确认没有缺点和样品外渗后进行芯片的装配。制备好的微阵列芯片于4 ℃、真空条件下贮存备用。

三、基于HPV-16多肽微阵列芯片的血清学检测

取2 μl血清加到198 μl血清稀释液中形成200 μl稀释血清，混匀后再加入微阵列芯片中，于摇床孵育仪上150 r/min孵育2 h；用洗液清洗多肽微阵列表面3次，再加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgG抗体，再次于摇床孵育仪上150 r/min孵育1 h；再用洗液清洗多肽微阵列表面3次，并在芯片表面涂上15 μl超敏化学发光底物(7.5 μl发光底物A+7.5 μl发光底物B)，在ImageQuant LAS 4000 mini化学成像分析仪中进行成像，曝光时间2 min。

四、数据处理

所得图像使用GenePix Pro 6.0软件进行处理，在波长635 nm处采集每一个信号点(包括阴阳性对照点和各条多肽)的信号值(signal intensity：即平均化学发光强度)以及芯片的背景信号值(background)。将采集的信号值(signal intensity)转化为信噪比(signal to noise ratio，SNR)形式，SNR=(signal intensity-background)/background。根据Hecker等[7]的方法，将某一点的信号值高于PB点的平均SNR值+3SD定义为截断值，则SNR>截断值为阳性血清学反应。为构建基于SNR=截断值的抗体响应谱，定义某一条多肽的响应覆盖率为该条多肽对某一类血清的阳性响应血清数与血清总数的比值。

五、统计学方法

统计学分析和统计图绘制使用R-Studio V3.0.2软件进行。采用微阵列芯片表达差异显著分析法(significance analysis of microarrays, SAM)分析计算前列腺癌患者和前列腺增生患者血清中具有差异性表达的多肽(优势多肽)，以q值<0.05为差异多肽入选标准，P<0.05为差异有统计学意义；使用受试者工作特征曲线(receiver operator characteristic curve, ROC)评估差异性表达自身抗体的诊断价值。

结 果

一、两组血清抗体筛选结果

血清学检测结果表明，iPDMS可以很好地将背景噪音控制在合理范围内。本实验中PB点的平均SNR值约为0.5±0.3，截断值约为1.4，这里取2，则SNR>2为阳性血清学反应。结果显示两组血清中均存在自身抗体响应情况，与HPV-16多肽反应的自身抗体既存在于前列腺癌患者中，也存在于前列腺增生患者中。进一步通过SAM计算对比两组血清中抗体响应的差异，发现存在15条多肽，与之响应的抗体在前列腺癌中高表达，与前列腺增生组相比差异有统计学意义(P<0.05)(图1)。

二、特异表达自身抗体诊断价值的评估

为评估前列腺癌患者血清中高表达自身抗体的诊断价值，分别对此15条差异性表达的多肽自身抗体作ROC曲线分析，对比每条多肽的曲线下面积，发现单指标难以达到十分理想的诊断效果(表2)。通过多次比较分析发现，联合此15条多肽构成的诊断模型能有效提高诊断效率，由此得到的ROC曲线下面积为0.772(95%置信区间0.700～0.843)(图2)，此时最佳临界值为3，在最佳临界值的诊断灵敏度为75.3%、特异度为61.8%。PSA的ROC曲线下面积为0.770(95%置信区间0.692～0.848)，诊断灵敏度为65.3%、特异度为83.9%。多肽联合诊断模型对前列腺癌有较高的诊断价值。

表2 单指标与多指标联合诊断模型在最佳临界值的诊断灵敏度和特异度及ROC曲线下面积

图1 差异表达的HPV-16自身抗体筛选(右上角红色圆圈代表在该15条多肽的自身抗体在前列腺癌患者中高表达)

讨 论

近年来，随着高通量检测平台例如噬菌体展示和蛋白质微阵列的快速发展，肿瘤相关自身抗体被发现并用作肿瘤早期的微创诊断工具。然而，血清中的抗体十分复杂，以致在筛选期间可出现模拟表位或分子模拟[6]。此外，免疫的多样性也可导致灵敏度与特异度之间的失衡[8]。仅仅依靠一条多肽的响应确定是否存在特异性的抗原抗体关系，其结果非常不可靠，存在大量的假阳性和假阴性。我们认为：如果一份血清同时对来自一个蛋白质的多条多肽有响应，其特异性抗原抗体响应的可靠性大大提高。但是多数情况下，一个蛋白质的线性表位有限(和蛋白质的大小有关，和免疫原性有关)，因此发生特异性抗原抗体的反应也有限。同理，如果一份血清对来自同一个病毒的多个蛋白质的多条多肽有响应，则发生特异性抗原抗体反应的抗体增加，诊断的可靠性也随之提高。因此，我们将HPV-16的7种蛋白质切割为241条多肽，以形成多肽微阵列芯片用于血清学筛查。结合SAM分析，成功地从241条多肽中筛选出在两组血清中具有差异性表达的15条多肽，联合此15条多肽构建的诊断模型，使得同一份血清对多条特异性多肽响应，大大提高了诊断的可靠性。

图2 15条多肽联合诊断的ROC曲线图和PSA的ROC曲线图

早在1990年，即有人通过Southern印迹和PCR等方法在前列腺癌组织细胞中检测出高危型HPV DNA[9-10]，证实前列腺癌与HPV感染有关；近年来也有研究重复了此类方法并得到相同的结论[5]。本实验以血清特异性抗原抗体反应为机制，用全新的血清学筛查方法，发现前列腺癌患者血清中存在与15条特异性HPV-16多肽反应的高表达抗体，且响应覆盖率明显高于前列腺增生组(P<0.05)，前列腺癌患者或存在HPV感染，并可以此方法区分前列腺增生患者。本实验结果也与许多流行病学研究结果类似[11-12]。Chen等[11]和Lin等[12]的研究发现有高达65%的前列腺癌患者存在HPV感染，并证实有数个高危型(HPV-16、HPV-18等)与前列腺癌病变的发生有关。诸多证据表明，HPV感染可能与前列腺癌疾病相关。

我们进一步建立ROC曲线评价血清中高表达抗体对前列腺癌的诊断价值。15条多肽联合诊断模型的ROC曲线下面积为0.772，在最佳临界值的诊断灵敏度为75.3%，特异度为61.8%。其ROC曲线下面积与PSA的0.770相似，而诊断灵敏度高于PSA(65.3%)，表明该模型对前列腺癌有较高的诊断价值。而相对较低的特异度，可能是由于血清中HPV免疫状态与实际组织中HPV感染不符，即血清中HPV相关抗体可能由前列腺解剖部位以外的HPV感染引起，导致假阳性结果。此外，既往感染与当前疾病状态的复杂联系也可能扰乱人类血清中的免疫应答反应。

HPV感染与前列腺癌发生、发展的机制尚未明确。大量研究表明HPV感染与许多肿瘤的发生有关，特别是宫颈癌[13]，为HPV感染与前列腺癌的关系提供了假设依据；同时，阴茎癌和尿道HPV病变的发现，也间接表明HPV病毒颗粒或可经尿道感染前列腺从而致病[14]；此外，分子学研究还表明HPV的E6和E7基因，编码的致癌蛋白可分别与肿瘤抑制蛋白Rb和P53结合并抑制其活性，最终使前列腺上皮细胞永生化[11]。

综上所述，前列腺癌患者血清中高度表达的特异性抗原抗体反应，表明HPV-16感染可能与前列腺癌的发生有关。我们通过对患者血清中特异性抗体的检测，可初步判断患者的患癌风险。本实验的一个主要优势是采用基于多肽微阵列芯片的血清学筛查方法，第一次研究中国人群中前列腺癌患者和前列腺增生患者血清中HPV-16相关特异性抗体水平的差异，并得到了较好的实验结果。然而实验中的样本量有限，实验条件也有待提高，在后续的研究中还需进一步完善。此外，联合血清学筛查和基因检测等方法或可以更好地评估前列腺癌与HPV感染的关系。

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(本文编辑：熊钰芬)

Application of HPV-16 peptides based microarray technology in the seroscreening of prostate cancer

ZHOUZheng,SUNYu-feng,GUOShuai,PUJin-xian,ZHAOXiao-jun.

DepartmentofUrology,theFirstAffiliatedHospitalofSoochowUniversity,Suzhou215006,ChinaCorrespondingauthor:ZHAOXiao-jun,E-mail:xiaojunzhao116@163.com

Objective To investigate the relationship between HPV-16 infection and prostate cancer by using the HPV-16 peptides based microarray in the seroscreening. Methods Antigen sequences from seven proteins of HPV-16 were cut into 20 mer peptides containing overlaps of 10 amino acids, resulting in a total of 241 HPV-16 peptide microarrays. 159 serum samples (72 prostate cancer subjects and 87 BPH samples) were included in the serological search. Significant analysis of microarray was used to identify peptides that performed differential expression between the two groups. Receiver operating characteristic (ROC) analyses were performed to assess the predictive value of the identified peptides when compared with PSA, and a p value < 0.05 was considered statistically significant. Results HPV-16 related antibodies existing in both prostate cancers and BPH patients, specific antibodies-epitope interactions performed different in the two groups. 15 peptides were identified as statistically significantly higher responding peptides in prostate cancer samples. ROC analyses showed that the diagnosis model with multi-index combination had higher diagnostic efficiency. The area under the ROC curve was 0.772, with sensitivity of 75.3% while a specificity of 61.8% when set the cutoff value to 3. Area under the ROC curve of PSA was 0.770, with sensitivity of 65.3% while a specificity of 83.9%. Conclusions Results showed HPV-16 related specific antibodies exists in prostate cancer and could be detected by HPV-16 based microarray.

Prostate cancer; HPV-16; Peptide microarray

215006苏州大学附属第一医院泌尿外科

赵晓俊，E-mail:xiaojunzhao116@163.com

10.3870/j.issn.1674-4624.2016.05.010

2016-09-20)