ELL基因在前列腺癌组织中的表达及其意义

刘凌琪 吴天鹏 钱辉军 杨嗣星 艾军魁 王洲

·临床研究·

ELL基因在前列腺癌组织中的表达及其意义

刘凌琪 吴天鹏 钱辉军 杨嗣星 艾军魁 王洲

目的分析ELL基因在人类前列腺癌组织中的表达情况，探讨其在前列腺癌发生发展中的作用。方法收集45例前列腺癌组织、15例良性前列腺增生组织和15例正常前列腺组织，提取总RNA，应用qRT-PCR检测ELL mRNA的表达情况，分析其与前列腺癌分级的关系。结果前列腺癌组织中ELL mRNA的表达量明显低于良性前列腺增生组织和正常前列腺组织(P<0.05)，而良性前列腺增生组织与正常前列腺组织间差异无统计学意义。随着前列腺癌Gleason评分的升高，ELL mRNA的表达呈下降趋势(P<0.05)。结论ELL基因在前列腺癌组织中呈低表达，其表达与前列腺癌的分级密切相关，提示其可能在前列腺癌的发生发展中发挥重要作用。

ELL基因； 前列腺癌； qRT-PCR

前列腺癌是老年男性常见的恶性肿瘤。在美国男性中，前列腺癌是最常见的恶性肿瘤，也是引起肿瘤相关死亡的第二位最常见原因[1]。随着我国人口老年化，前列腺癌的发病率呈明显上升趋势。目前，对前列腺癌的治疗策略包括根治性前列腺切除术、冷冻手术、体外放射治疗、近距离放射治疗、化学治疗和激素治疗等[2-3]，尽管大多数治疗效果显著，但对激素非依赖性前列腺癌的治疗仍是难点。

人类ELL(eleven-nineteen lysine-rich leukemia)基因最早定位于染色体19p13.1。在多种白血病中,ELL基因常常与定位于染色体11q23 上的混合系白血病基因(mixed lineage leukemia，MLL)发生染色体易位[4]。研究发现，ELL基因在调节动物发育和肿瘤生成中具有重要作用[5]。但是，对于ELL基因在前列腺癌中的表达情况，以及其与前列腺癌恶性程度的关系等国内外尚无相关报道。为了更好了解ELL基因在前列腺癌发生发展中的作用，我们采用qRT-PCR分析ELL基因在前列腺癌组织、良性前列腺增生组织及正常前列腺组织中的表达情况，以探讨其与前列腺癌发生发展的关系。

对象与方法

一、一般资料

2010年7月至2014年3月于我院泌尿外科收集前列腺癌组织45例，良性前列腺增生组织15例，全膀胱切除术中的正常前列腺组织15例，以良性前列腺增生组织和正常前列腺组织作为对照。所有标本在术中取得后置入准备好的液氮中速冻10 min，然后于-70 ℃冰箱保存。所有标本均得到病理学证实。前列腺癌患者的中位年龄为68岁。Gleason评分：<7分20例；=7分18例；>7分7例。

二、试剂与仪器

RNA提取使用RNeasy Mini Kit试剂盒，购自Qiagen公司。反转录生成cDNA模板使用High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit试剂盒，购自Applied Biosystems公司。利用Omiga 2.0软件设计特异性ELL和18S引物，PCR反应全部引物由北京奥科公司合成。Real-time PCR使用SYBR Green PCR Master Mix Kit试剂盒，购自Invitrogen公司。PCR仪器为Applied Biosystems 公司的ABI Step-One Plus thermocycler。

三、方法

前列腺癌组织、良性前列腺增生组织和正常前列腺组织(各100 mg)分别按照RNeasy Mini Kit试剂盒说明书的操作步骤提取总RNA。使用分光光度计检测RNA浓度；应用High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit试剂盒，按照说明书操作进行反转录实验，生成cDNA模板；以基因的cDNA序列为模板利用Omiga 2.0软件设计特异性引物；应用SYBR Green PCR Master Mix Kit试剂盒，按照说明书操作，在ABI Step-One Plus thermocycler上进行反应；使用R=2[Cp sample-Cp control]的公式，以18S为内参照，对数据进行分析。反转录反应体系为无菌去离子H2O 3.2 μl，10×RT Buffer 2.0 μl，25×dNTP Mix(各2.5 mmol/L) 0.8 μl，10×RT Random Primers 2.0 μl，Reverse Transcriptase 1.0 μl，RNase Inhibitor 1.0 μl，RNA 10.0 μl(含5 μg RNA)。反应条件为25 ℃ 10 min，37 ℃ 120 min，85 ℃ 5 s，4 ℃ 保存。qRT-PCR引物:ELL引物为5′-ACTGCATCCAGCAGTATGTCTCCA-3′和5′-TCCGAAACTGAACCTTCTTGCCCA-3′;18S引物为5′-CATTCGTATTGCGCCGCT-3′和5′-CGACGGTATCTGATCGTC-3′。qRT-PCR反应体系为无菌去离子H2O 5.6 μl，2×PCR mix 10.0 μl，cDNA 2.0 μl，Primers(10μmol/L) 2.0 μl，Rox 0.4 μl。反应条件为95 ℃ 3 min，94 ℃ 30 min，50 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s,进入第2步，重复32个循环，72 ℃ 10 min。

四、统计学方法

ABI 7500荧光定量PCR仪检测结果由ABI 7500 Prism software 系统进行分析后导入SPSS 17.0 统计软件处理，组间进行方差分析，方差分析后的两两比较采用Post-hoc方法，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、ELL基因在前列腺癌组织、良性前列腺增生组织和正常前列腺组织中的表达

qRT-PCR检测45例前列腺癌组织、15例正常前列腺组织和15例良性前列腺增生组织中ELL mRNA的表达，结果显示前列腺癌组织中ELL的相对表达量为0.74±0.11，正常前列腺组织为1.51±0.28，良性前列腺增生组织为1.41±0.34。One-way方差分析结果为F=104.74(P<0.05)，提示3组间ELL mRNA的表达差异有统计学意义。Post-hoc比较显示前列腺癌组织与正常前列腺组织间差异有统计学意义(P<0.05)，说明与正常前列腺组织相比，ELL基因在前列腺癌中呈低表达;前列腺癌组织与良性前列腺增生组织间比较差异有统计学意义(P<0.05)，说明与良性病变相比，ELL基因在肿瘤性病变中呈低表达；与正常前列腺组织相比，良性前列腺增生组织中ELL基因的表达并无显著性变化，差异无统计学意义(P>0.05)，说明良性病变不影响ELL基因的表达。

二、前列腺癌组织中ELL基因表达与Gleason评分的关系

根据Gleason评分不同，将前列腺癌标本分为3组，其中<7分的20例，ELL的相对表达量为0.85±0.04；=7分的18例，ELL的相对表达量为0.69±0.04；>7分的7例，ELL的相对表达量为0.58±0.02(表1)。One-way方差分析结果为F=140.92(P<0.05)，提示三者之间比较差异有统计学意义。随着Gleason评分的增加，ELL基因的表达呈下降趋势，提示ELL基因的表达与前列腺癌组织的分化程度相关。

三、前列腺癌组织中ELL基因表达与PSA的关系

根据PSA水平不同，将前列腺癌标本分为3组，其中<10 μg/L的23例，ELL的相对表达量为0.84±0.04；10～20 μg/L的14例，ELL的相对表达量为0.68±0.02；>20 μg/L的8例，ELL的相对表达量为0.59±0.02(表1)。三者之间比较差异有统计学意义(F=175.49，P<0.05)。随着PSA水平的增高，ELL基因的表达呈下降趋势，说明ELL基因表达与PSA水平呈负相关。

四、前列腺癌组织中ELL基因表达与前列腺癌危险因素的关系

根据我国前列腺癌诊疗指南，将前列腺癌危险因素等级分为低危、中危、高位。其中低危的18例，ELL的相对表达量为0.84±0.04；中危的18例，ELL的相对表达量为0.68±0.02；高危的9例，ELL的相对表达量为0.59±0.03(表1)。三者之间比较差异有统计学意义(F=125.18，P<0.05)。随着肿瘤危险性的增加，ELL基因表达下降，表明ELL基因的表达与前列腺癌的危险性呈负相关。

表1 前列腺癌组织中ELL mRNA相对表达量与Gleason评分、PSA和前列腺癌危险因素的关系

讨 论

ELL基因的组织表达谱相当广泛，其在骨骼肌、胎盘、睾丸和外周血白细胞中有较高表达。在造血细胞中，T细胞、B细胞和骨髓细胞系都存在ELL基因表达。ELL基因家族有3个成员，分别是ELL、ELL2、ELL3，均为真核生物RNA Pol Ⅱ转录延伸因子，功能研究发现通过抑制DNA启动子依赖和非依赖模板上多位点的短暂中止，ELL能增强Pol Ⅱ转录延伸的催化率[6]。同时，在转录起始前复合物形成期间，ELL基因通过直接与多聚酶结合从而打断该酶与TBP和TFIIB在启动子区的固有结合，发挥抑制转录起始的作用[6]。ELL基因是胚胎发育过程中至关重要的延伸因子，因为ELL基因敲除的小鼠都发生了胚胎性死亡[7]。ELL基因能抑制细胞生长和诱导凋亡[5]。ELL基因可以作为协同调节者选择性调节甾体激素受体的功能。ELL基因能显著抑制人类盐皮质激素受体和糖皮质激素受体介导的转录活性，对雄激素受体和孕酮受体却没有影响[8]。

我们前期的研究发现EAF2/U19能抑制前列腺癌的生长，而U19诱导细胞凋亡和抑制细胞生长的作用是通过其与ELL结合的区域来实现的[9]。在慢病毒转染稳定高表达ELL的PC-3细胞系中，ELL基因能抑制细胞生长，并抑制细胞的克隆形成，其潜在的机制可能是通过抑制HIF-1α信号通路，进而抑制血管生成[10]。后续研究又发现ELL基因可以作为转录因子直接诱导TSP-1 (thrombospondin-1)基因的转录，ELL基因能在体内调节TSP-1 mRNA 表达，并能抑制血管生成[11]。这些研究表明，ELL-EAF2信号通路与血管生成信号通路之间可能存在交互作用。

目前，对于ELL基因的研究主要集中在体外细胞实验和动物实验研究的层面，鉴于我们前期研究发现ELL基因的体内外抑制肿瘤细胞生长的现象，本研究通过qRT-PCR技术对前列腺癌临床标本的ELL基因表达量进行了分析，发现前列腺癌组织中ELL mRNA的表达量显著低于正常前列腺组织和良性前列腺增生组织，差异有统计学意义,而正常前列腺组织和良性前列腺增生组织之间无显著性差异。这说明前列腺癌可显著降低ELL基因的表达，而良性病变并不改变ELL基因的表达，也可能是因为ELL基因表达降低，从而诱发了恶性病变。分化程度高的前列腺癌组织中ELL mRNA表达较高，而分化程度低的前列腺癌组织中ELL mRNA 表达量较低，差异有统计学意义，说明ELL基因可能起到促进前列腺癌肿瘤细胞分化成熟的作用。同时，从本研究可以看出，ELL基因的表达与患者PSA呈负相关，且差异有统计学意义。ELL基因表达与前列腺癌的危险因素也存在负相关，差异有统计学意义。说明ELL基因的表达缺失可能导致肿瘤细胞的运动能力增强和失去生长抑制，从而引起前列腺癌的发生、浸润和转移。因此，我们推测ELL基因在前列腺癌的发生和发展过程中可能起到抑制作用。

对于ELL基因的研究，目前处于试验阶段，尚无FDA批准的试剂盒。本研究延续前期结果，进一步探讨ELL基因在前列腺癌标本中的表达情况，证实了ELL基因在前列腺癌发生和发展过程中的负性调控作用，可为ELL基因作为前列腺癌临床分子治疗靶点和预测前列腺癌预后复发等提供坚实的研究基础。

[1] Jemal A, Siegel R, Ward E, et al. Cancer statistics, 2008[J]. CA Cancer J Clin,2008,58(2):71-96.

[2] Setlur SR, Rubin MA. Current thoughts on the role of the androgen receptor and prostate cancer progression[J]. Adv Anat Pathol,2005,12(5):265-270.

[3] Michaelson MD, Cotter SE, Gargollo PC, et al. Management of complications of prostate cancer treatment[J]. CA Cancer J Clin,2008,58(4):196-213.

[4] Thirman MJ, Levitan DA, Kobayashi H, et al. Cloning of ELL, a gene that fuses to MLL in a t(11;19)(q23;p13.1) in acute myeloid leukemia[J]. Proc Natl Acad Sci U S A,1994,91(25):12110-12114.

[5] Johnstone RW, Gerber M, Landewe T, et al. Functional analysis of the leukemia protein ELL: evidence for a role in the regulation of cell growth and survival[J]. Mol Cell Biol,2001,21(5):1672-1681.

[6] Shilatifard A, Haque D, Conaway RC, et al. Structure and function of RNA polymerase II elongation factor ELL. Identification of two overlapping ELL functional domains that govern its interaction with polymerase and the ternary elongation complex[J]. J Biol Chem,1997,272(35):22355-22363.

[7] Mitani K, Yamagata T, Iida C, et al. Nonredundant roles of the elongation factor MEN in postimplantation development[J]. Biochem Biophys Res Commun,2000,279(2):563-567.

[8] Pascual-Le Tallec L, Simone F, Viengchareun S, et al. The elongation factor ELL (eleven-nineteen lysine-rich leukemia) is a selective coregulator for steroid receptor functions[J]. Mol Endocrinol,2005,19(5):1158-1169.

[9] Hahn J, Xiao W, Jiang F, et al. Apoptosis induction and growth suppression by U19/Eaf2 is mediated through its ELL-binding domain[J]. Prostate,2007,67(2):146-153.

[10] Liu L, Ai J, Xiao W, et al. ELL is an HIF-1alpha partner that regulates and responds to hypoxia response in PC3 cells[J]. Prostate,2010,70(7):797-805.

[11] Zhou J, Feng X, Ban B, et al. Elongation factor ELL (Eleven-Nineteen Lysine-rich Leukemia) acts as a transcription factor for direct thrombospondin-1 regulation[J]. J Biol Chem,2009,284(28):19142-19152.

(本文编辑：徐汉玲)

Expression of ELL and its significance in prostatic carcinoma

LIULing-qi*,WUTian-peng,QIANHui-jun,YANGSi-xing,AIJun-kui,WANGZhou.

*DepartmentofUrology,RenminHospitalofWuhanUniversity,Wuhan430060,ChinaCorrespondingauthor：LIULing-qi,E-mail:llqfly@163.com

Objective To investigate the expression of ELL in human prostatic carcinoma. Methods Samples of prostatic carcinoma tissues, samples of BPH tissues and samples of normal prostate tissues were collected. The ELL mRNA level was detected by qRT-PCR. Results The ELL mRNA level in prostatic carcinoma tissues was significantly lower than in BPH tissues and in normal prostate tissues. However, there was no difference between in BPH tissues and in normal prostate tissues. There was a decreasing trend of ELL mRNA level during the increasing Gleason scores in prostatic carcinoma. Conclusions ELL has low expression in prostatic carcinoma tissue, and it was closely related to the grade of prostatic carcinoma, which indicates ELL may play an important role in the development and progression of prostatic carcinoma.

ELL gene； Prostate cancer； qRT-PCR

国家自然科学基金项目青年项目(81101948)

430060 武汉大学人民医院泌尿外科(刘凌琪、吴天鹏、钱辉军、杨嗣星)；美国匹兹堡大学泌尿系(艾军魁、王洲)

刘凌琪,E-mail:llqfly@163.com

10.3870/j.issn.1674-4624.2016.05.009

2016-01-09)