健脾益智胶囊对MCAO大鼠海马NT3及学习记忆能力的影响

（福建中医药大学，福建福州350122）

实验研究

健脾益智胶囊对MCAO大鼠海马NT3及学习记忆能力的影响

冯珂，纪立金

（福建中医药大学，福建福州350122）

［目的］探讨健脾益智胶囊对大脑中动脉栓塞（MCAO）大鼠海马神经营养素3（NT3）及学习记忆能力的影响。［方法］建立MCAO大鼠模型，随机分为正常组、假手术组、模型组、西药组、中药组。采用免疫组化法、Bederson评分、Morris水迷宫实验、跳台实验于术后7 d、14 d、28 d观察MCAO大鼠海马NT3的表达及学习记忆能力的改善情况。［结果］随着术后时间的增加，模型组、西药组、中药组大鼠Bederson评分逐渐减少，组内各时间点的评分均有显著性差异（P<0.05）；与模型组比较中药组与西药组同时间点评分差异显著（P<0.05），且中药组评分优于西药组（P<0.05）。随着术后时间的增加，Morris水迷宫实验中模型组、中药组、西药组逃避潜伏期逐渐缩短，穿越原平台次数逐渐增多；跳台实验潜伏期逐渐延长，错误次数逐渐减少（P<0.05）。中药组均较同时间点模型组、西药组水迷宫实验逃避潜伏期缩短，穿越次数增多；跳台实验潜伏期延长，错误次数减少（P< 0.05）。免疫组化实验显示，术后7 d中药组NT3阳性细胞数明显多于模型组、西药组（P<0.05）；术后14 d中药组NT3阳性细胞数与西药组无明显差异（P＞0.05）；术后28 d中药组NT3阳性细胞数明显多于模型组、西药组（P＜0.05）。［结论］健脾益智胶囊可促进MCAO大鼠学习记忆能力的恢复，促进MCAO大鼠海马NT3表达增加，提示健脾益智胶囊可能通过诱导NT3表达以达到恢复脑缺血后学习记忆能力的目的。

健脾益智胶囊；大脑中动脉栓塞模型；Morris水迷宫实验；跳台实验；NT3；实验研究

脑卒中是临床常见病、多发病，具有高发病率、高病死率、高致残率和高复发率的特点。缺血性脑卒中占脑卒中发病率的60%～80%［1］，目前尚无有效治疗手段，患者预后差的主要原因是脑缺血损伤再灌注后坏死的脑组织修复不佳。中医药对神经功能缺损疾病的治疗有较好效果，本实验建立大脑中动脉栓塞（MCAO）大鼠模型，采用免疫组化法、Bederson评分和Morris水迷宫实验、跳台实验等行为学检测，评价健脾益智胶囊对MCAO模型大鼠学习记忆能力的改善情况，并探讨其机制，为临床治疗缺血性脑卒中提供有力的实验依据。

1 实验材料

1.1 动物SPF级健康雄性SD大鼠120只，13周龄，体质量280～300 g，由上海斯莱克实验动物中心提供，许可证号：SCXK（沪）2007-0005。适应性饲养6 d后，随机分为正常组、假手术组、模型组、西药组、中药组。每组按存活时间再分为7 d、14 d、28 d亚组，每亚组8只。

1.2 试剂与仪器NT3兔抗大鼠多克隆抗体（武汉博士德生物工程有限公司，货号：BA1293）；Mayor’s苏木素（Sigma公司，Lot No.07G03A05）；PBS（pH7.2～7.6，武汉博士德生物工程有限公司，Lot No.07c16B30）；枸橼酸盐缓冲液（武汉博士德生物工程有限公司，AR0024）；即用型SABC（小鼠IgG）免疫组化试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司，Lot No. 07K21cJ）；即用型SABC（兔IgG）免疫组化试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司，Lot No.07K15BJ）；DAB显示试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司，Lot No.07127c22）；10%水合氯醛（福建中医药大学证研究基地）；HM315R石蜡切片机（德国MICROM）；STP-120全自动生物组织脱水机（德国MICROM）；EC-350生物组织包埋机（德国MICROM）；摊片机（德国MICROM）；烤片机（德国MICROM）；BX51T-PHD-J1三目显微镜［奥林巴斯（中国）有限公司］；大鼠跳台仪DTT-2（中国医学科学院药物研究所）；Morris水迷宫、大鼠迷宫自动程序记录仪（中国医学科学院药物研究所）。

1.3 药物健脾益智胶囊由人参、黄芪、白术、制何首乌、石菖蒲、远志、水蛭组成，中药均购自福建中医药大学国医堂，由福建中医药大学制药厂代加工。胶囊每粒内容物重0.3 g，1 g内容物相当于含生药10 g。实验时制备成健脾益智胶囊0.9%氯化钠溶液混悬液（0.2 g/ml），备用。西药尼莫地平（国药准字H41022175，郑州瑞康制药有限公司，每片20 mg），实验时制备成0.9%氯化钠溶液混悬液（1 mg/ml），备用。

2 方法

2.1 MCAO模型复制与给药参照文献［2］复制模型，术后2 h参照Bederson评分法［3］进行行为学评分，评价大鼠脑缺血后神经功能缺损程度，评分达2分以上的大鼠纳入研究。此后分别于7 d、14 d、28 d处死取材，处死前进行行为学评分。中药组术后给予健脾益智胶囊混悬液［3.675 ml/（kg·d）］，西药组给予尼莫地平混悬液［10 ml/（kg·d）］。模型组、假手术组给予0.9%氯化钠溶液，正常组常规饲养。

2.2 大鼠行为学检测

2.2.1 Morris水迷宫实验迷宫由圆形水池、平台两部分组成。水池直径120 cm，高60 cm，池壁漆成黑色，在池壁上四个等距离点将水池分为四个象限，直径为9 cm的平台置于任一象限中央，淹没于水下2 cm，于造模前进行Morris水迷宫训练，实验分为定位航行实验和空间探索实验，历时5 d，每天于固定时间段进行训练，每个时段4次。每次试验分别从东、西、南、北4个点入水，入水时大鼠面向池壁。记录大鼠找到平台所需时间即逃避潜伏期。如大鼠在2 min内找不到平台，则由实验者将其引导向平台，其潜伏期为120 s。自动录像系统记录大鼠找到平台的时间和游泳途径。空间探索实验于第6天撤除原平台，任选一个入水点将大鼠放入水中，所有大鼠必须为同一入水点，记录大鼠在2 min内穿越原平台的次数。在各时间点处死前5天，进行测试，记录逃避潜伏期、穿越原平台的次数。

2.2.2 跳台实验造模前对大鼠进行跳台试验的学习训练，将大鼠放入箱内适应3 min后，接通电源，大鼠受电击后跳至跳台上，如此反复5 min，记录大鼠受电击后跳至跳台上的时间及受电击次数。第2日进行测试训练，将大鼠放于跳台之上，即刻通电，记录5 min内大鼠第1次从跳台上跳下的时间（这段时间称为潜伏期），并同时记录大鼠跳下跳台受电击的次数（称为错误次数），潜伏期和错误次数作为反应大鼠记忆能力的指标。在各时间点处死前2天，再次进行跳台测试训练，记录潜伏期、错误次数。

2.3 NT3免疫组化检测免疫组化采用SABC（链霉亲和素生物素过氧化物酶复合物）法，操作步骤按试剂盒说明书进行。

2.4统计学分析采用SPSS 11.5软件统计分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，作单因素方差分析和t检验，以P<0.05为有统计学意义。

3 结果

3.1 健脾益智胶囊对MCAO大鼠脑缺血后神经行为学评分的影响见表1。

表1 各组大鼠不同时间段脑缺血后神经功能缺损评分比较（分±s）

表1 各组大鼠不同时间段脑缺血后神经功能缺损评分比较（分±s）

注：与模型组比较，①P<0.05；与西药组比较，②P<0.05；与同组术后7 d比较，③P<0.05；与同组术后14 d比较，④P<0.05；下同

正常组24000假手术组24000模型组242.62±0.922.12±0.64③1.50±0.76③④西药组242.12±0.64①1.63±0.52①③0.88±0.35①③④中药组241.87±0.83①②1.13±0.64①②③0.50±0.53①②③④组别n7 d14 d28 d

表1结果显示，正常组、假手术组Bederson神经功能评分均为0分；与模型组同时段比较，西药组、中药组Bederson评分均明显下降，差异均有统计学意义（P<0.05），其中中药组Bederson评分改善更显著，与西药组比较有显著性差异（P< 0.05）。

3.2 水迷宫实验结果见表2。

表2 各组大鼠Morris水迷宫实验逃避潜伏期及穿越原平台次数比较（±s）

表2 各组大鼠Morris水迷宫实验逃避潜伏期及穿越原平台次数比较（±s）

逃避潜伏期（s）穿越原平台（次/分）逃避潜伏期（s）穿越原平台（次/分）逃避潜伏期（s）穿越原平台（次/分）正常组2425.54±3.086.11±1.5325.45±3.056.12±1.4725.51±2.936.11±1.50假手术组2425.42±3.036.06±1.4325.51±3.066.10±1.4025.49±3.026.10±1.39模型组2445.01±3.122.04±1.0138.65±4.02③3.27±1.33③30.40±2.55③④3.72±1.48③④西药组2440.89±5.86①2.20±1.12①32.30±3.36①③3.76±1.84①③28.67±2.53①③④5.13±1.49①③④中药组2438.26±4.97①②2.38±1.07①②29.68±3.54①②③4.11±1.78①②③25.89±3.14①②③④5.57±1.48①②③④n 7 d14 d28 d组别

表2结果显示，术后7 d、14 d、28 d，中药组、西药组均较同时间点模型组逃避潜伏期缩短，穿越原平台次数增多，差异有显著性意义（P<0.05）；与西药组同时间点比较，中药组逃避潜伏期缩短更明显，穿越原平台次数增多更明显（P<0.05）。术后14 d、28 d，模型组、中药组、西药组均较同组术后7 d逃避潜伏期缩短，穿越原平台次数增多（P<0.05）；术后28 d较术后14 d逃避潜伏期缩短，穿越次数增多（P<0.05）。

3.3 跳台实验结果见表3。

表3 各组大鼠跳台实验潜伏期及错误次数比较（±s）

表3 各组大鼠跳台实验潜伏期及错误次数比较（±s）

潜伏期（s）错误次数（次）潜伏期（s）错误次数（次）潜伏期（s）错误次数（次）正常组24249.93±14.191.94±0.88250.10±12.762.06±0.88250.23±12.732.02±0.90假手术组24250.21±8.131.95±0.82250.07±7.991.96±0.80250.23±8.141.98±0.79模型组2440.15±2.155.34±1.8064.38±2.85③3.57±1.16③135.86±4.58③④3.06±1.17③④西药组2454.01±2.34①4.05±1.35①149.35±8.20①③2.94±1.32①③214.00±4.42①③④2.55±1.29①③④中药组2455.25±3.15①②3.84±1.30①②156.39±8.07①②③2.43±1.00①②③242.61±5.48①②③④2.22±1.05①②③④n 7 d14 d28 d组别

表3结果显示，术后7 d、14 d、28 d，中药组、西药组均较同时间点模型组潜伏期延长，错误次数减少，差异有显著性意义（P<0.05）；与西药组同时间点比较，中药组潜伏期延长更明显，错误次数减少更明显（P<0.05）。术后14 d、28 d，模型组、中药组、西药组均较同组术后7 d潜伏期延长，错误次数减少（P<0.05）；术后28 d较术后14 d潜伏期延长，错误次数减少（P<0.05）。

3.4 健脾益智胶囊对NT3阳性细胞数的影响见表4、图1。

表4 各组大鼠海马区NT3阳性细胞数比较（±s）

表4 各组大鼠海马区NT3阳性细胞数比较（±s）

正常组2421.87±4.2421.78±4.2821.67±4.17假手术组2421.85±4.3721.74±4.4421.83±4.47模型组2425.15±2.8020.81±4.44③12.62±2.80③④西药组2431.76±1.54①24.98±2.57①③12.79±2.77③④中药组2435.50±4.15①②25.48±4.20①③15.69±2.30①②③④组别n7 d14 d28 d

图1 光镜下NT3免疫细胞检测图

表4结果显示，术后7 d，中药组、西药组较模型组NT3阳性细胞数明显增加（P＜0.05）；与西药组比较，中药组NT3阳性细胞数增加更明显（P＜0.05）。术后14 d，与模型组比较，中药组及西药组NT3阳性细胞数增加显著（P＜0.05），但中药组及西药组两组比较无统计学意义（P＞0.05）；术后28 d，与模型组比较，中药组NT3阳性细胞数增加显著（P＜0.05），西药组NT3阳性细胞数无明显增加（P＞0.05）。与同组术后7 d比较，模型组、中药组、西药组术后14 d、28 d NT3阳性细胞数均明显减少（P＜0.05）；术后28 d较术后14 d NT3阳性细胞数明显减少（P＜0.05）。

4 讨论

认知障碍在脑卒中患者中发病率高达56.6%［4］，其中45.4%脑卒中后认知障碍患者主要表现为学习记忆能力下降［5］。缺血性脑卒中发生后，由于脑组织缺血缺氧进而发生一系列复杂的病理改变，导致大脑神经元破坏和死亡［6］，最终出现学习记忆减退等功能障碍。

NT3是在胚胎期及发育期成活和发育所必需的一种蛋白质［7-8］，能促进神经嵴细胞进行有丝分裂并诱导其分化［9］，并参与神经突触的形成和神经突起的生长［10］。目前国内外对神经生长因子（nerve growth factor，NGF）和脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）等研究较多，而NT3与缺血性脑卒中的相关性研究较少。有研究表明NT3缺乏或者含量不足会对学习记忆功能产生影响，并与AD等神经退行性疾病密切相关。而NT3能阻止胆碱能神经元退变，改善因基底前脑胆碱能神经元退变引起的学习记忆功能障碍［11］。

脑卒中后由于脑组织结构功能的异常，卒中后患者一般会遗留半身不遂、语言障碍、口眼斜等症状，且较易出现会出现焦虑、抑郁、妄想、谵妄、人格变态、痴呆等神志障碍，这些都属于中医“智”的异常。中医认为脾藏意，主思，生智，故在缺血性脑卒中治疗方面，确立了健脾益智的治疗方法。

本研究中，健脾益智胶囊干预后的MCAO大鼠在Morris水迷宫实验中表现出大鼠逃避潜伏期明显缩短，穿越原平台次数明显增多，其获得经验（学习）能力、保存经验（记忆）的能力以及视空间识别的能力均有明显恢复，优于模型组、西药组；跳台法实验中，中药组MCAO大鼠在跳台上的潜伏期明显变长，犯错受电击次数明显减少，学习记忆能力有明显恢复，优于模型组、西药组。Morris水迷宫实验、跳台实验结果表明健脾益智胶囊可促进MCAO大鼠学习记忆能力的恢复。在同期免疫组化实验中，术后7 d MCAO大鼠海马NT3阳性细胞数明显增多；随着时间的推移，术后14 d、28 d MCAO大鼠海马NT3阳性细胞数逐渐减少，至28 d已低于正常水平；术后7 d、28 d中药组阳性细胞数明显多于西药组。据上述结果我们推断出，健脾益智胶囊可能通过诱导NT3的表达来实现学习记忆能力的恢复，至于NT3如何使得MCAO大鼠学习记忆能力恢复还有待于进一步研究。

（本文源自冯珂的博士学位论文）

［1］中华医学会神经病学分会脑血管病学组急性缺血性脑卒中诊治指南撰写组.中国急性缺血性脑卒中诊治指南2010［J］.中华神经科杂志，2010，43（2）：146-153.

［2］Longa E Z，Weinstein P R，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］.Stroke，1989，20（1）:84.

［3］Bederson J B，Pitts L H，Tsuji M，et al.Rat middle cerebral artery occlusion:evaluation of the model and development of a neurologic examination［J］.Stroke，1986，17（3）:472.

［4］曲艳吉，卓琳，詹思延.中国脑卒中后认知障碍流行病学特征的系统评价［J］.中华老年心脑血管病杂志，2013，14（12）：1294-1301.

［5］胡昔权，窦祖林，万桂芳，等.脑卒中患者认知功能障碍的发生率及其影响因素的探讨［J］.中华物理医学与康复杂志，2003，25（4）：219-222.

［6］Jin R，Song Z，Yu S，et al.Phosphatidylinositol-3-kinase gamma plays a central role in blood-brain barrier dysfunction in acute experimental stroke［J］.Stroke，2011，42（7）：2033-2044.

［7］Fox E A，McAdams J.Smooth-muscle-specific expression of neurotrophin-3 in mouse embryonic and neonatal gastrointestinal tract［J］.Cell Tissue Res，2010，340（2）：267-286.

［8］Sahenk Z，Galloway G，Edwards C，et al.TrkB and TrkC agonist antibodies improve function，electrophysiologic and pathologic features in Trembler mice［J］.Exp Neurol，2010，224（2）：495-506.

［9］Gavazzi I，Kumar R D，McMahon S B，et al.Growth responses of different subpopulat ions of adult sensory neurons to neurtroph ic factors in vitro［J］.Eur J Neurosci，1999，11（10）：3405-3414.

［10］Hossain W A，Brumwell C L，Morest D K.Sequential in teractions of fibroblast growth factor-2，brain-derived neurotrophic factor，neurotrophin-3，and their receptors define critical periods in the development of cochlear ganglion cells［J］.Exp N eurol，2002，175（1）:138-151.

［11］Fischer W，Sirevaag A，Wiegand S J，et al.Reversal of spatial memory impairments in aged rats by nerve growth factor and neurotrophin-3 and 4/5 but not by brain-derived neurotrophic factor［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1994，91（18）:8607-8611.

（编辑 陈明伟）

Effects of Jianpiyizhi Capsule on Expression of NT3 in the Hippocampus and Learning and Memorizing Ability of MCAO Rats

FENG Ke，JI Li－jin
（FujianUniversityof TraditionalChineseMedicine，Fuzhou，Fujian，350122）

［Objective］To detect the effects of Jianpiyizhi capsule on learning and memorizing ability of middle cerebral artery occlusion（MCAO）rats.［Methods］The MCAO model rats were randomly divided into 5 groups：normal control group，sham operation group，MCAO model group，Nimodipine group，Jianpiyizhi group.The expression of NT3 in hippocampus and the learning and memory ability of MCAO rats were observed by immunohistochemical method，Bederson score，Morris water maze test and stepdown test at 7d，14d and 28d after operation.［Results］With the increase of the postoperative time，the Bederson scores of MCAO model group，Nimodipine and Jianpiyizhi group gradually reduced.Bederson scores were significant different in each group at each time point（P＜0.05）.The scores of Nimodipine and Jianpiyizhi groups at the same time－point were significant different compared with that of MCAO model group（P＜0.05）.And the score of Jianpiyizhi group was better than that of Nimodipine group（P＜0.05）.With the increase of the postoperative time，the escape latency of MCAO model group，Nimodipine and Jianpiyizhi groups was gradually shortened and the frequency of crossing the original platform was gradually increased in Morris water maze test.The latency of the experiment was gradually prolonged and the number of errors decreased gradually（P＜0.05）.At the same time point，the escape latency，frequency of crossing the original platform，the latency of the experiment and the number of errors in Morris water maze testofJanpiyizhigroupwassignificantlydifferentlyfromthatofMCAOmodelgroupandNimodipinegroup（P＜0.05）.Immunohistochemical experiments showed that the number of NT3 positive cells on the 7th day after surgery of the Jianpiyizhi group were significantly higher than that in MCAO model group and Nimodipine groups（P＜0.05）.No significant difference was noted in the number of NT3 positive cells on the 14th day after surgery between Janpiyizhi group and Nimodipine group（P＞0.05）.The number of NT3 positive cells on the 28th day after surgery of the Jianpiyizhi group were significantly higher than that in MCAO model group and Nimodipine groups（P＜0.05）.［Conclusion］Janpiyizhi capsule can promote the recovery of learning and memory ability of MCAO rats and facilitate the expression of NT3 in hippocampus of MCAO rats.It is suggested that the capsule could achieve the purpose of recovery of learning and memory after cerebral ischemia through the induction of NT3 expression.

Jianpiyizhi capsule；middle cerebral artery occlusion model；Morris water maze test；step－down avoidance test；NT3；experimental research

R285.5

A

2095-4441（2016）04－0001－05

2016－10－13

国家自然科学基金资助项目（编号：81373528）

冯珂（1983-），女，汉族，山东淄博人，博士，讲师，研究方向：中医藏象理论

纪立金，E-mail：666j@163.com