沙棘籽粕原花青素制备、体外抗氧化及细胞活力评价

张佳婵,王昌涛,孙宝国,曲悠歌

(1.天津科技大学食品工程与生物技术学院,天津 300457;2.北京食品营养与人类健康高精尖创新中心 北京工商大学,北京 100048;3.植物资源研究开发北京市重点实验室 北京工商大学,北京 100048;4.食品添加剂与配料北京高校工程研究中心 北京工商大学,北京 100048)



沙棘籽粕原花青素制备、体外抗氧化及细胞活力评价

张佳婵1,2,王昌涛2,3,孙宝国2,4,*,曲悠歌3

(1.天津科技大学食品工程与生物技术学院,天津 300457;2.北京食品营养与人类健康高精尖创新中心 北京工商大学,北京 100048;3.植物资源研究开发北京市重点实验室 北京工商大学,北京 100048;4.食品添加剂与配料北京高校工程研究中心 北京工商大学,北京 100048)

本实验优化了沙棘籽粕原花青素的提取方法,条件为80%乙醇,提取温度35 ℃,液料比8∶1 mL/g,时间1.5 h,pH3.0,在该条件下的原花青素提取率为(97.31±0.48) mg/g沙棘籽粕;对提取得到的原花青素提取物进行了DPPH自由基和羟自由基清除能力实验,并分析得到IC50,发现沙棘籽粕原花青素提取物的DPPH自由基清除能力较维生素C强;羟自由基清除能力较弱;MTT法测定了沙棘籽粕原花青素提取物对小鼠B16黑色素瘤细胞活力的抑制作用,分析得到24、48、72 h处理时间下提取物IC50分别为542.78、199.25、82.58 μg/mL。结论:沙棘籽粕提取物对小鼠B16黑色素瘤细胞具有一定的抑制作用,随着剂量和时间的增加,呈逐渐增强的趋势。

沙棘籽粕原花青素,抗氧化,细胞活力

沙棘(HippophaerhamnoidesL.),主要存在于亚欧大陆,是我国西部生态治理的优选植物。大量研究证实了沙棘具有抗炎、抗癌[1-3]等功效。沙棘籽粕是沙棘籽经过脱油处理后的副产物,N A Ushakova等人[4]研究发现沙棘籽粕中含有较多纤维素、半纤维素等物质,一般作为饲料或废弃物丢弃,造成了资源的浪费。前期研究发现原花青素是沙棘籽粕中最主要的极性活性成分,且含量较高,若能将沙棘籽粕中的活性成分原花青素提取并加以利用,将显著提高沙棘籽粕的利用价值,提高经济效益。

很多食源性的原花青素可以在日常生活中被人们所摄取,并且具有很强的生物活性,如降血糖[5]、抗癌[6]、预防心血管疾病[7]等。沙棘原花青素的功效作用也引起了少量研究者的重视:Heejin Kim[8]发现沙棘籽水提物具有潜在的预防皮肤光老化的功效;在C Widen[9]的研究中,沙棘具有比其他浆果更好的保护红细胞免受氧化应激损害的功效;Manimaran Manickam[10]还发现沙棘水提物还可以通过影响JAK/STAT信号通路来减轻神经细胞免受缺氧损害。由于文献中沙棘原花青素是从沙棘果实中提取得到,有别于沙棘籽粕原花青素的提取位置,可能含有不同种类或配比的原花青素,所以初步探索沙棘籽粕中的原花青素功能特性也具有一定的意义。

本实验优化了沙棘籽粕原花青素的提取方法,并对提取后的原花青素粗提物进行了化学抗氧化功效评价及细胞实验,探索了沙棘籽粕原花青素提取物对DPPH自由基和羟自由基的清除能力,以及对小鼠B16黑色素瘤细胞活力的抑制作用,本实验的完成为沙棘籽粕原花青素的更深一步的功效研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

沙棘籽粕 青海康普生物科技股份有限公司;芦丁、原花青素 中国药品生物制品检定所;亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、无水乙醇、盐酸、邻二氮菲 北京化工厂;抗坏血酸(分析纯≥99.7%) 国药集团化学试剂有限公司;DPPH(1,1-二苯基苦基苯肼)、胰酶(1∶250) 美国Sigma Aldrich公司;DMEM培养基、新生牛血清、PBS、1×105U/L青霉素、100 mg/L链霉素 美国GIBCO生命技术公司;小鼠黑色素瘤细胞株B16 中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心。

BS2202S型电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司;DSHZ-300恒温水浴振荡器 江苏省太仓市实验设备厂;2-16N型医用高速离心机 湖南恒诺仪器设备有限公司;Elx-808型酶标仪 美国Bio-Tek公司;T6 新世纪紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 原花青素含量的测定 原花青素含量的测定方法参考相关文献[10],并做适当修改。

标准曲线的绘制:准确配制1 mg/mL浓度的原花青素-甲醇标准溶液作为母液。分别量取0.25、0.5、1、1.5、2、2.5 mL母液于6只离心管中,再分别量取4.75、4.5、4、3.5、3、2.5 mL甲醇溶液将6个不同浓度标准样品补齐至5 mL。所得六种浓度的标准溶液分别为0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL。再取6只离心管,分称取不同浓度标准溶液0.5 mL,各加入2.5 mL 3%香草醛-甲醇溶液及2.5 mL 30%硫酸的甲醇溶液。30 ℃水浴反应20 min。测定500 nm下吸光度值。制定浓度与吸光度值的标准曲线。用0.5 mL甲醇代替标准溶液重复操作,作为参比液。

样品的测定:取待测样品0.5 mL于离心管,分别加入2.5 mL 3%香草醛-甲醇溶液及2.5 mL 30%硫酸的甲醇溶液。30 ℃水浴反应20 min。测定500 nm下吸光度值。对应标准曲线计算待测样品中原花青素含量。

1.2.2 沙棘籽粕原花青素提取溶剂的选择 固定提取温度40 ℃、液料比6∶1 mL/g、自然pH(pH为5～5.5),提取时间2 h,转速120 r/min,选择文献报道的常见[10]提取溶剂丙酮、甲醇、乙醇为研究对象,探讨0、20%、40%、60%、80%、100%这六种浓度对提取率的影响。设置三组平行。

1.2.3 沙棘籽粕原花青素提取工艺的单因素实验 液料比单因素实验:设置液料比分别为6∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1 mL/g,固定乙醇浓度为80%,提取温度40 ℃,提取时间2.0 h,自然pH(pH为5～5.5),将提取液减压抽滤后定容到100 mL容量瓶中,混合均匀后测定原花青素含量。设置三组平行。

温度单因素实验:将提取温度分别设定为20、30、40、50、60 ℃,固定乙醇浓度80%,提取时间2.0 h,液料比6∶1 mL/g,自然pH(pH为5～5.5),将提取液减压抽滤后定容到100 mL容量瓶中,混合均匀后测定原花青素含量。设置三组平行。

提取时间单因素实验:固定因素乙醇浓度80%,提取温度40 ℃,液料比6∶1 mL/g,自然pH(pH为5～5.5)时,提取时间分别为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 h,将提取液减压抽滤后定容到100 mL容量瓶中,混合均匀后测定原花青素含量。设置三组平行。

提取pH单因素实验:固定因素乙醇浓度80%,提取温度40 ℃,液料比6∶1 mL/g,提取时间2.0 h,提取pH分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0,将提取液减压抽滤后定容到100 mL容量瓶中,混合均匀后测定原花青素含量。设置三组平行。

1.2.4 沙棘籽粕原花青素乙醇提取工艺的正交实验 在单因素实验的基础上,选取考察的四个单因素进行正交设计,按照正交设计表格(表1)进行实验,并测定原花青素含量。

表1 正交实验因素水平表
Table 1 Orthogonal factor level table

水平因素A温度(℃)B液料比(mL/g)C时间(h)DpH1258∶1152523010∶1203033512∶12535

1.2.5 DPPH自由基清除实验 DPPH自由基清除实验方法参照文献[11],并做适当修改。

取1.5 mL待测液加入到1.5 mL 2×10-4mol/L DPPH溶液中,迅速混匀,室温下避光静置30 min后于517 nm下测吸光度值,记录为A1。

取1.5 mL无水乙醇加入到1.5 mL 2×10-4mol/L DPPH溶液中,迅速混匀,室温下避光静置30 min后于517 nm下测吸光度值,记录为A2。

取1.5 mL 无水乙醇加入到1.5 mL待测液中,迅速混匀,室温下避光静置30 min后于517 nm下测吸光度值,记录为A3。

DPPH自由基清除率的计算公式为:

清除率(%)=100%×(A2+A3-A1)/A2

1.2.6 羟自由基清除实验 羟自由基清除实验参照文献[12-13],并做适当修改。取0.5 mL 0.75 mmol/L邻二氮菲无水乙醇溶液于试管中,依次加入1 mL 0.15 mol/L磷酸盐缓冲溶液(PBS,pH7.40)和0.5 mL蒸馏水,充分混匀后,加入0.5 mL 0.75 mmol/L硫酸亚铁溶液(FeSO4),混匀后,加入0.5 mL 0.01%双氧水(H2O2),于37 ℃水浴60 min后,在536 nm测其吸光值,所得数据为损伤管吸光度A损伤。未损伤管以0.5 mL蒸馏水代替损伤管中的0.5 mL 0.01%双氧水,操作方法同损伤管,可测得536 nm未损伤管的吸光度值A未损伤。样品管以0.5 mL样品代替损伤管中的0.5 mL蒸馏水,操作方法同损伤管,可测得536 nm样品管中的吸光度A样品。

按照下式计算样品对·OH的清除率:

清除率I(%)=(A样品-A损伤)/(A未损伤-A损伤)×100

1.2.7 粗提原花青素冻干粉的制备 采用正交实验所得的最优实验方法进行原花青素的提取,对所得原花青素进行冷冻干燥,条件为-80 ℃,0.03 mbar,48 h。由此得到沙棘籽粕原花青素粉末。

1.2.8 粗提原花青素的抗氧化活性 将粗提原花青素冻干粉配制不同浓度的粗提原花青素溶液,对不同浓度原花青素溶液分别进行DPPH自由基和羟自由基清除率实验。

1.2.9 细胞与细胞培养 小鼠黑色素瘤细胞株B16培养于含10%新生牛血清、1×105U/L青霉素、100 mg/L链霉素的DMEM培养基,置于37 ℃、5% CO2饱和湿度的培养箱中,以0.05%胰酶消化传代。

1.2.10 MTT法检测粗提原花青素对小鼠B16细胞活力的影响 实验方法参照文献[14],并做适当修改。取对数生长期B16细胞以0.05%胰酶消化、细胞培养液制备成单细胞悬液,接种于96孔细胞培养板中,每孔100 μL、5000个细胞,过夜后每孔加入100 μL含不同浓度样品的培养液或空白对照组培养液,实验设置调零组、细胞对照组、实验组。实验组粗提原花青素培养液浓度分别为454.45、90.91、45.45、9.09、4.55 μg/mL,每组至少6个平行孔。37 ℃、5% CO2条件下培养,分别处理24、48、72 h。常规方法加入5 mg/mL MTT溶液处理,DMSO溶解,37 ℃孵育10 min,测定490 nm下吸光度值。

细胞活力(%)=(实验组-调零组)/(细胞对照组-调零组)×100

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 沙棘籽粕主要成分测定

表2为沙棘籽粕主要成分及活性物质含量表,依照国标GB/T 18868-2002《饲料中水分、粗蛋白质、粗纤维、粗脂肪、赖氨酸、蛋氨酸快速测定 近红外光谱法》测定沙棘籽粕中的粗蛋白质、粗纤维、粗脂肪含量,分别为17.90±0.47、11.20±0.78、6.74±0.78 g/100 g干物质;依照GB/T 5009.88-2008《食品中膳食纤维的测定》测定沙棘籽粕总膳食纤维含量,为(33.20±1.47) g/100 g干物质。数据分析发现,沙棘籽粕纤维类物质含量较多,高达45%。此外,还含有其他未知成分约31 g/100 g干物质。

表2 沙棘籽粕主要成分含量
Table 2 Chemical compounds of seabuckthorn seed residues

项目含量(g/100g干物质)粗脂肪674±078粗蛋白质1790±047粗纤维1120±078总膳食纤维3320±147

2.2 提取溶剂的筛选

丙酮、乙醇、甲醇是常用的活性成分提取溶剂,三者均可不同程度的渗透植物细胞,使原花青素溶出。图1显示不同提取溶剂在不同浓度下提取原花青素的结果。丙酮、乙醇、甲醇随着溶剂浓度的逐渐升高(0%～80%范围),均有利于原花青素的提取,当100%纯溶剂提取时,仅有甲醇的提取率较高,乙醇和丙酮下降迅速,且以丙酮下降幅度最大。该结果与红莲外皮原花青素的提取[15]结果略有不同,彭芳刚在研究红莲外皮原花青素的提取工艺时,同样考察了该三种提取溶剂,结果发现:在一定范围内,均随着浓度的升高而提取效果增强,但是浓度大于80%时,提取效果骤然下降;但是与本论文结果相异的是,丙酮的提取效果为最好。这可能是由于研究对象的不同,沙棘籽粕的主要物质及结构与红莲外皮差异较大,故与溶剂的作用机制不同。因此,本论文同时考虑到甲醇毒性较高,且乙醇为溶剂提取原花青素的得率也已达到80 mg/g,处于较高水平,所以选择80%乙醇为提取溶剂,进行后续实验。

图1 提取溶剂及浓度对原花青素含量的影响Fig.1 Effect of extraction solutions and concentration on proanthocyanidin content

2.3 多种因素对沙棘籽粕原花青素提取效果的影响

2.3.1 提取时间对沙棘籽粕原花青素提取效果的影响 图2显示为不同提取时间对沙棘籽粕原花青素的提取效果的影响,由结果可以看出,提取时间在2 h时,已达到最高水平,随后时间继续延长不会提高原花青素的含量,因此选择2 h作为后续实验的提取时间。

图2 提取时间对原花青素含量的影响Fig.2 Effect of extraction time on proanthocyanidin content注:字母表示原花青素含量的差异性;字母不同表示差异显著(p<0.05)，图3～图5同。

2.3.2 提取pH对沙棘籽粕原花青素提取效果的影响 图3为不同提取pH(3.0、4.0、5.0、6.0、7.0)对沙棘籽粕原花青素的提取效果的影响,随着pH的升高,提取效果下降,这可能是由于原花青素含有较多的酚羟基,在酸性条件下更有助于保持结构稳定。彭芳刚[15]在研究红莲外皮原花青素时,也选择pH3.0为研究条件,其认为酸性条件下有利于原花青素的溶出。所以本项目选择pH3.0为后续实验条件。

图3 提取pH对原花青素含量的影响Fig.3 Effect of extraction pH on proanthocyanidin content

2.3.3 提取温度对沙棘籽粕原花青素提取效果的影响 本项目探讨了不同提取温度对原花青素提取效果的影响,随着提取温度的升高,分子运动速度加快,渗透、扩散以及溶解的速度提高,一般活性成分的提取率也随之增加[15]。该规律可以解释提取温度<30 ℃时,原花青素提取含量升高的现象。但是,随着温度的升高,由于原花青素不稳定,使提取效果下降[16],因此选择30 ℃为后续实验反应条件。

图4 提取温度对原花青素含量的影响Fig.4 Effect of reaction temperature on proanthocyanidin content

2.3.4 液料比对沙棘籽粕原花青素提取效果的影响 图5为不同液料比(mL/g)对原花青素提取效果的影响。图5可知,液料比在10∶1、15∶1、20∶1、25∶1时均保持较高的DH,且水平之间无显著性差异。所以选取液料比为10∶1,作为后续实验条件。

图5 液料比对原花青素含量的影响Fig.5 Effect of the ratio of liquorto material on proanthocyanidin content

2.4 正交实验优化沙棘籽粕原花青素提取工艺条件

根据单因素实验结果,分别对温度、液料比、时间、提取pH进行正交实验设计。实验设计结果及数据分析表如表3所示。四个因素对沙棘籽粕原花青素提取效果的影响为:A>D>C>B(温度>提取pH>时间>液料比)。最佳提取因素组合为:A3B1C1D2。因此,沙棘籽粕提取原花青素的最优工艺为提取溶剂80%乙醇,提取温度35 ℃、液料比8∶1、时间1.5 h、pH3.0。

表3 正交实验结果及数据分析表
Table 3 Orthogonal Test Results

实验号A温度(℃)B液料比(mL/g)C时间(h)D提取pH原花青素含量(mg/g)1111148.732122255.493133360.734212372.795223160.306231287.357313296.158322383.569332161.96K154.9872.5673.2157.00K273.4866.4563.4179.66K380.5670.0172.3972.36R25.586.119.8022.67

表4 正交实验结果验证
Table 4 Verification Results of Orthogonal Test

实验条件沙棘籽粕原花青素提取实验液料比(mL/g)8∶1提取温度(℃)35提取时间(h)1.5pH3.0乙醇浓度(%)80提取量(mg/g)97.31±0.48

2.5 优化条件的结果验证

将以上优化的反应条件进行3组验证实验,提取结果为(97.31±0.48) mg/g(表4),表明正交实验优化的工艺条件可行。

2.6 抗氧化活性研究

常用体外抗氧化测定方法可分为4类:活性氧自由基清除能力;基于氢原子转移(HAT)的检测方法;基于 SET 反应机制的抗氧化实验方法;金属离子螯合法[12]。基于不同的抗氧化机理以及实验室的实验条件,本课题选择了两种实验机理(基于活性氧自由基清除能力和基于SET反应机制)的自由基清除方法对所得样品进行测定。图6、图7分别为不同浓度原花青素冻干粉对DPPH自由基和羟自由基清除能力的结果。以维生素C为阳性对照,对比了两者的抗氧化性区别,从图6对DPPH的结果来看,沙棘籽粕原花青素冻干粉表现出较高的清除能力,且随着浓度的增加,清除能力呈递增趋势,通过计算提取物IC50为0.11 mg/mL,维生素C的IC50为0.25 mg/mL;而清除羟自由基的能力较低。马翠兰在蓝莓叶片蓝莓叶片原花青素清除自由基能力的研究中发现,蓝莓叶片原花青素不仅可以显著清除DPPH自由基,也具有羟自由基清除能力,且以维生素C为对照,其羟自由基清除能力高于维生素C[17]。由此可见,推测原因可能是原花青素的组成成分及结构的差异也会造成其抗氧化性能的不同。本项目所得的沙棘籽粕原花青素冻干粉,具有较强的基于SET反应机制的自由基清除能力。

图6 不同浓度原花青素提取物对DPPH自由基的清除能力Fig.6 DPPH free radical scavenging rates of proanthocyanidin freeze-dried powder

图7 不同浓度原花青素提取物对羟自由基的清除能力Fig.7 OH free radical scavenging rates of proanthocyanidin freeze-dried powder

2.7 沙棘籽粕原花青素对B16细胞活性的研究

本实验用不同浓度沙棘籽粕原花青素冻干粉处理对数生长期小鼠B16黑色素瘤细胞,处理时间分别为24、48、72 h,结果见图8。三种处理条件下样品刺激B16细胞的IC50结果见表5。由图8所示,三种处理时间下,小鼠B16细胞活力均随着样品浓度的降低呈上升趋势,说明较高浓度的沙棘籽粕原花青素对B16细胞有一定的抑制作用。随着处理时间的延长,细胞耐受相同浓度的样品能力下降:24 h处理时间,B16细胞活力为50%时,原花青素含量为542.78 μg/mL,48 h时,IC50为199.25 μg/mL,72 h下,细胞活力在50%时的IC50低至82.58 μg/mL。

图8 不同浓度原花青素提取物对B16细胞活力的影响Fig.8 B16 Cell viability of proanthocyanidin freeze-dried powder注:A:处理细胞24 h;B:处理细胞48 h;C:处理细胞72h。

项目处理时间(h)IC50(μg/mL)12454278248199253728258

3 结论

本实验以副产物沙棘籽粕为研究对象,优化沙棘籽粕原花青素的提取条件,并初步分析沙棘籽粕原花青素的抗氧化功效,同时进行了对B16细胞的抑制活性实验。实验结果显示,沙棘籽粕原花青素具有清除DPPH自由基的功效,清除效果优于维生素C。72 h作用时间处理B16细胞的IC50为82.58 μg/mL(即82.58 mg/L),高于文献报道莲房原花青素对B16细胞的半数抑制率32.4 mg/L[18],说明本实验所得沙棘籽粕原花青素粗品比莲房原花青素对B16细胞的刺激程度较低;本实验沙棘籽粕原花青素24 h作用时间处理B16细胞的IC50为542.78 μg/mL,低于文献报道的杨梅叶原花青素的IC50,文献报道杨梅叶原花青素在50 mg/mL时得细胞活力为68.28%[19]。这又揭示了本实验所得沙棘籽粕原花青素比杨梅叶原花青素对B16细胞的刺激程度强。因此,为了更全面和透彻的分析本实验所得样品的安全性和功效性,需进行进一步的实验。

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Technological conditions,antioxidant activities in vitro and cell viability of the proanthocyanidins extracted from seabuckthorn(Hippophae rhamnoides L.)seed residues

ZHANG Jia-chan1,2,WANG Chang-tao2,3,SUN Bao-guo2,4,*,QU You-ge3

(1.College of Food Engineering and Biotechnology,Tianjin University of Science and Technology,Tianjin 300457,China; 2.Beijing Key Laboratory of Plant Resources Research and Development,School of Science of Beijing Technology and Business University,Beijing 100048,China; 3.Beijing Advanced Innovation Center for Food Nutrition and Human Health,Beijing Technology and Business University,Beijing 100048,China; 4.Beijing Higher Institution Engineering Research Center of Food Additives and Ingredients, School of Food and Chemical Engineering of Beijing Technology and Business University,Beijing 100048,China)

The optimal conditions of proanthocyanidins extracted from seabuckthorn(HippophaerhamnoidesL.)seed residues were obtained by orthogonal test,on the basis of one factor tests. The optimal condition of ethanol extraction was ethanol concentration 80%,temperature 35 ℃,liquid to solid ratio 8∶1 mL/g,extraction time 1.5 h,pH3.0. Under this condition,proanthocyanidins was 97.31±0.48 mg/g seabuckthorn(HippophaerhamnoidesL.)seed residues. Antioxidant activities were tested,using crude extract lyophilized power. Antioxidant activities of proanthocyanidins extracted from seabuckthorn(HippophaerhamnoidesL.)seed residues were investigated with the method of scavenging hydroxyl and DPPH. IC50was calculated. Results indicated that the proanthocyanidin extracts had higher antioxidant activity than vitamin C on the scavenging ability of DPPH. The ability on scavenging hydroxyl was low. Methods MTT assay was employed to determine the cell viability of proanthocyanidin extracts in B16 cells. The IC50was 542.78,199.25 and 82.58 μg/mL when B16 cells was exposed for 24,48,and 72 h,respectively.It was suggested that the B16 cell viability followed the dose-and time-dependent manner.

proanthocyanidins extracted from sea buckthorn(HippophaerhamnoidesL.)seed residues;antioxidant activity;cell viability

2016-05-16

张佳婵(1987-)，女，博士生，研究方向：食品生物技术，E-mail：xiaochan8787@163.com。

*通讯作者:孙宝国(1961-)，男，博士，教授，研究方向：食品香料与风味化学，E-mail：sunbg@btbu.edu.cn。

质检公益性行业科研专项(201310132)；质检公益性行业科研专项(201410019)。

TS202.3

A

1002-0306(2016)23-0103-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.23.011