细菌共培养及其系统中群体感应现象的研究进展

励建荣,国竞文,李婷婷

(1.渤海大学食品科学研究院,辽宁省食品安全重点实验室,辽宁锦州 121013;2.大连民族学院生命科学学院,辽宁大连 116600;3.西南大学食品学院,重庆 400715)



细菌共培养及其系统中群体感应现象的研究进展

励建荣1,国竞文1,李婷婷2,3,*

(1.渤海大学食品科学研究院,辽宁省食品安全重点实验室,辽宁锦州 121013;2.大连民族学院生命科学学院,辽宁大连 116600;3.西南大学食品学院,重庆 400715)

本文对微生物的共培养方式、分类、发展及应用进行了简介,并对不同种属的微生物共培养后产生的作用进行了综述。微生物共培养系统不仅受到协同代谢作用的调控,群体感应在微生物共培养中也扮演着重要的角色。与纯培养相比,共培养体系生物被膜的形成、信号分子和毒力因子的产生、细菌素的合成以及胞外蛋白酶的分泌等都有所不同。研究群体感应的作用机理有助于共培养技术的进一步发展与应用。

微生物,共培养,协同代谢,群体感应

人们对微生物的研究大多局限于纯培养方式,对于微生物共培养的研究较少,其实微生物共培养存在着巨大的研究潜力,不同种属的微生物之间共培养后会产生迥然不同的作用[1]。目前对于共培养的研究大多都是从协同代谢出发的,很少有人涉足群体感应对共培养体系调控作用的研究,直到最近才有人开始关注群体感应在共培养中的作用。共培养(Co-culture)是指在无菌条件下,一些特别指定的不同的微生物在厌氧或好养条件下的混合培养[2]。群体感应(Quorum-sensing,QS)系统是细菌间利用信号分子进行交流的一种方式,即当细菌的菌体数量达到一定密度时细菌会发生感应现象进而调控性状表达[3]。一般来讲,群体感应对单个细菌菌体是没有意义的,而对大量的细菌菌体来说是非常重要的,真核生物或是原核生物都具有群体感应现象。食品处于复杂的微生物体系中,多种微生物在同一环境中会产生不同的作用,因此仅仅研究群体感应对微生物纯培养的影响远远不够,对于共培养体系中群体感应调控作用的研究迫在眉睫。因此本论文主要针对微生物共培养系统中的群体感应现象做出论述,旨在为微生物共培养技术的发展及共培养系统中群体感应调控作用的研究提供一定的理论基础。

1 微生物共培养

1.1 共培养的简介

人们对于微生物的利用是一个逐步发展的阶段,最初只是天然的混合培养(Mixed-culture),比如传统发酵食品如乳制品、豆制品、肉制品的制作以及食醋、黄酒等的酿造均是利用了发酵体系中多种微生物之间的代谢作用。在18世纪末期纯培养(Pure culture)技术开始发展,同时极大的促进了医学、生命科学和工农业等领域的发展。在1925年Sack[4]首次报道了关于微生物共培养的研究,指出亚消化单胞菌(Nitrosomonassp.)和生丝微菌(Hyphomicroblumsp.)在硅胶培养基中共培养时组合关系不同则形成不同的产物。最近几十年人们又逐渐认识到多种不同种属的微生物共培养能够产生特有的新物质或者提高产量[5-7]。共培养微生物之间有着较为复杂的生态学关系,其中涉及协同代谢、互利共生、相互拮抗、细菌素、信号分子之间的相互作用等,这些作用在一定程度上都影响着共培养体系中物质的产量和新物质的产生。

1.2 共培养的方式及特点

微生物的共培养方式主要分为直接共培养、共固定化细胞混菌培养和间接共培养三种。直接共培养是指在一定的环境条件下,两种或两种以上细胞按照特定比例在同一体系中共同培养的过程。在这种培养方式中常伴随着协同代谢、信号转导、群体感应等多种复杂的微生态关系,共固定化细胞混菌培养是指采用共固定化生物技术将单个细菌制成固定化细胞后混合在一起。利用这种培养方式在避免了微生物直接接触产生抑制作用的同时又可以发挥代谢物之间的信息传递。间接共培养是指将不同的微生物细胞置于特定的、互不接触的载体上而在同一体系中培养[2]。这种共培养方式的优点与共固定化细胞混菌培养相同,虽然实际应用中这种方式没有被广泛采用,但是理论上它对于研究微生物代谢产物之间的相互作用以及揭示种间的群体感应现象和信号分子的产生有重要意义。

1.3 共培养的应用

利用共培养技术可以改造传统的发酵工艺,使发酵周期缩短且产品质量提高,如利用戊糖乳杆菌和肠膜明串珠菌共培养生产泡菜,在降低泡菜中腐败菌数目的同时还可以改善泡菜的风味[8]。共培养可以产生新的物质,如将枯草芽孢杆菌与放线菌共培养能够产生纯培养时不存在的抗肿瘤抗生素[9],显示了共培养对于新抗肿瘤抗生素发现的重要性。共培养可以提高物质产量,如将巨大曲霉和尖孢镰刀菌共培养时发现抗真菌蛋白的产量明显提高[10],这是微生物共培养技术的一大优势,在当下的研究中也备受关注。共培养可以降解有毒物质,这可能是源于微生物共培养时产生的协同作用,因此在降解有毒物时更加高效,如同时使用透明分枝杆菌与枝孢菌清除柴油时可以显著提高清除率[11]。

2 协同代谢作用对共培养的调控

共培养微生物之间存在多种协同代谢作用,如为彼此提供营养物质、对底物的竞争利用、改变体系的pH等。有报道指出细菌在纯培养时生物活性容易降低,生物量也会减少,但是将细菌进行混合培养在一定程度上可以减少或避免这一现象的发生[12-13]。这可能是由于细菌混合培养后产生了协同作用,细菌间的代谢增加。巨大芽孢杆菌与古龙酸菌共培养时能够为彼此提供营养物质,因而新陈代谢增强[14]。

Huang等[15]对分离自肉制品中的两株粪肠球菌Enterococcusfaecium(E.faeciumB1和E.faeciumB2)与单增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)进行了共培养研究,E.faeciumB1中含有类细菌素物质和肠道菌素基因,而E.faeciumB2中没有,并且二者对L.monocytogenes都有一定的抑制作用。在共培养的早期E.FaeciumB1对L.monocytogenes有抑制作用,而E.faeciumB2没有产生抑制作用,由此推测是E.FaeciumB1中的类细菌素物质对L.monocytogenes的生长产生了抑制作用。同时测定了培养液中的pH发现,共培养的pH低于单一纯培养的pH,表明共培养时产生的酸性物质抑制了L.monocytogenes的生长。对于没有产细菌素基因的E.FaeciumB2来说,它对L.monocytogenes的抑制作用可能是由于细胞与细胞之间对于营养物质的竞争作用。例如Nilsson等[16]已经证实,不产细菌素基因的栖鱼肉杆菌会因为竞争葡萄糖而对李斯特菌产生抑制作用。

Mellefont等[17]对单増李斯特菌(L.monocytogenesScott A)与大肠埃希式菌(E.coliM23)、荧光假单胞菌(P.fluorescens44)、乳酸杆菌(L.plantarumALC 01)分别进行共培养的研究中发现,混合体系中的协同增长的作用差异与混合培养浓度比例有一定关系,当混合浓度相当时,协同增长作用最显著;当共培养L.monocytogenesScott A初始浓度较低时,它的生长会受到其它细菌的抑制;相反,当L.monocytogenesScott A初始浓度比P.fluorescens44和L.plantarumALC 01高时,P.fluorescens44和L.plantarumALC 01的生长都会受到抑制,但是E.coliM23的生长不受影响,共培养体系的pH也会发生相应变化。推测原因可能是共培养时某一个细菌分泌了对其它细菌生长不利的抑制因子,也可能是由于对培养体系中底物的利用能力不同产生的生长差异。此外肉汤培养的温度不同也会影响共培养中单增李斯特菌与植物乳杆菌的竞争作用[18]。除此之外,Geng等[19]也曾报道过将硝化细菌和反硝化细菌进行混合培养能够加速硝化反应的进程还能稳定系统中的pH。

对于微生物共培养的研究大多都是从协同代谢角度出发的,从群体感应角度研究的较少,然而群体感应在微生物共培养中扮演着重要角色。

3 群体感应系统

3.1 细菌群体感应

细菌的群体感应依赖细菌的数量达到一定密度才能发生,细菌可以通过产生、释放、检测以及对信号分子做出相应的反应来实现菌体之间的交流,这些信号分子又称“自诱导物(Autoinducer,AI)”。人们最早是在20世纪70年代从海洋费式弧菌(Vibriofisheri)中发现了群体感应现象的存在[20],费式弧菌能够调控发光,而群体感应可以调控发光的强度[21],并且这种发光现象与菌体数量有关,当费式弧菌菌体浓度增加时,AHLs信号分子的浓度也会相应升高,当达到一定阈值后就会与受体蛋白结合,使受体蛋白的构象发生相应变化,靶基因被激活[22]。鉴于群体感应现象的发现,科学家的注意力从研究单个细胞的行为转移到多细胞行为的研究上,并且人们发现QS与果蔬的腐烂、水产品的腐败、牛奶及奶制品的腐败等密切相关,QS现已经广泛应用到医药、生物防治、食品质量安全和水产品腐败控制等方面。介导微生物群体感应的信号分子有多种,而不同种类的细菌在调控QS系统的基因表达时利用的信号分子结构不同。

3.2 群体感应系统的分类

常见的QS系统主要分为以下4类:

革兰氏阴性菌中的群体感应系统(AI-1):革兰氏阴性细菌的群体感应系统,主要分泌的是N-酰基-高丝氨酸内酯(N-3-acyl-homoserine lactones,AHLs)类物质,也叫做AI-1,它是由一个相对稳定的高丝氨酸内酯环和一条长度包含4至18个碳的酰基侧链组成,其酰基侧链上可能形成双键或第三个碳上容易被羟基或氧取代,这些可变性决定了AHLs的特异性[23]。目前已在许多细菌中发现类似费式弧菌LuxI/LuxR系统的群体感应系统,如根癌农杆菌的TraI/TraR系统,铜绿假单胞菌的LasI/LasR系统和Rh1I/Rh1R系统等[24]。

革兰氏阳性菌的群体感应系统(AIP):革兰氏阳性菌的信号分子为寡肽(auto-inducing polypeptides,AIPs)类物质,它与AI-1结构不同,是经过加工或修饰的自身分泌的前导肽。AIPs有直链的也有环状的,含有5～26个氨基酸残基[25-26]。AIPs不能自由出入细胞,要经过细胞壁需在ABC转运系统的协同作用下才能达成[27]。

细菌种属间的群体感应系统(AI-2):除了以上两类信号分子之外,细菌用于种间交流的是另外一类信号分子AI-2(autoinducer-2),细菌通过感受环境中AI-2的浓度从而了解环境中自身和其他细菌的数量,以此来调控自身的表型表达。AI-2类信号分子是由LuxS蛋白质催化合成的呋喃硼酸二酯(Furanosyl borate diester)[28]。

细菌的其他群体感应机制:在一些肠道共生细菌、肠致病性大肠杆菌等革兰氏阴性菌中发现了AI-3型群体感应系统,但是其作用机制尚不明确,推测结构可能和肾上腺素/去甲肾上腺素相似,且E.coli中AI-3分子的合成并不依赖于LuxS蛋白[29];在铜绿假单胞菌中还发现了2-庚基-3-羟基-4-喹诺酮(2-heptyl-3-hydroxyl-4-quinolone)类信号分子,其次级代谢产物可以调控假单胞菌毒性基因的表达;在弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfreundii)等细菌的培养上清液中发现了二酮哌嗪类化合物DKP(diketopiperazine),也是AI信号分子的一种,这类信号分子对细菌种内及种间的群体感应都起着重要的调控作用[30]。

4 群体感应对共培养的调控作用

群体感应调控着细菌共培养的多个方面,比如生物被膜的形成、信号分子的产生、毒力因子的产生、细菌素的合成、胞外蛋白酶的分泌等。

4.1 对生物被膜的调控作用

生物被膜是指微生物为了适应环境而粘附于惰性或活性实体的表面,繁殖、分化并分泌一些多糖基质、蛋白质和核酸等,将菌体群落包裹其中而形成的细菌聚集体膜状物[31]。被膜的形成是一个多级过程,包括细菌表面的粘附,细胞间集聚和繁殖,多聚基质的产生、生长、成熟,最终被膜分散或降解。QS的调控涉及被膜形成的所有阶段,它通过调节细菌的种群密度和成熟被膜内的新陈代谢来适应营养需求[32]。生物被膜普遍存在于食品表面和食品的加工车间中,清除困难且容易导致食品的二次污染。在生物被膜的保护下,细菌应对抗生素、环境压力以及来自外界的攻击防御能力都会增强。因此抑制生物被膜的形成在一定程度上可以延长食物保质期。有关生物被膜的最早报道是Costerton等[33]对于牙斑菌的生物被膜的研究,近年来有大量研究表明,许多菌种生物被膜的形成都受到群体感应系统的调控。Brackman等[34]研究了伯霍尔德杆菌属(Burkholderia)生物被膜的形成,发现其受群体感应系统的调控,并且肉桂醛和白藜芦醇有抑制生物被膜粘附的能力。群体感应对生物被膜的调控作用不仅仅局限于单个细菌的纯培养中,对于不同种属细菌的共培养体系也会有一定的影响。杨安林[35]曾提到,加入细菌培养上清液后大肠杆菌生物被膜OD630的值比单独培养大肠杆菌有所增加,尤其是金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的上清液能够明显增强大肠杆菌生物被膜的形成能力,并且加入量、OD值与生物被膜形成能力之间呈现一定的浓度依赖性;加入铜绿假单胞菌和单増李斯特菌后OD630值增幅不明显。这表明不同种属细菌进行共培养时体系的生物被膜形成能力存在差异性,充分了解复杂的共培养体系中生物被膜的形成规律,找到有效抑制生物被膜形成的方法,有利于控制由于生物被膜粘附而导致的食品污染与腐败现象。

4.2 对信号分子的调控作用

朱晶等[36]对多株乳酸菌、肠毒素大肠杆菌(EnterotoxigenicEscherichiacoli,ETEC)和猪小肠上皮细胞系IPEC-J2共培养发现,乳酸菌能够使ETEC对IPEC-J2的毒力作用显著降低,其中乳酸菌S8能够明显促进ETEC的AI-2分泌。这表明乳酸菌可能通过向环境中分泌某种物质来影响ETEC LuxS系统AI-2的产生,使ETEC的毒力基因无法正常表达。郭倩茹等[37]对分离自酸马奶酒中的9株乳酸菌、8株酵母菌进行两次共生筛选后得出了三对典型的共生组合,酵母菌YSTT2代谢产物均能促进LAB4、LAB7、LAB9这3株乳酸菌产生AI-2,共培养YST2与LAB4、YST2与LAB9极显著的促进了乳酸菌AI-2的产生。Di等[38]将酵母乳杆菌LactobacillusplantarumDC400与其他乳酸杆菌共培养时发现DC400的LuxS基因调控的AI-2的产生会受影响。以上研究表明,微生物共培养会影响信号分子AI-2的产生。由于共培养体系可能同时受到多种信号分子的调控,因此仅仅研究共培养液中AI-2的变化还远远不够,对于添加外源AI-2后是否也会产生类似的趋势还有待于进一步验证。

4.3 对毒力因子产生的调控作用

毒力因子可以帮助病原体侵入宿主,并且对于宿主的自我防御功能有相应的抵抗机制,从而使病原体更具致病危害性。研究表明,一些QS系统参与了毒力因子的产生和运输过程。如葡萄球菌毒力因子的产生会受到QS的调控[39]。在创伤弧菌中,溶血素基因vvhA和蛋白酶基因vvpE在其QS系统中起重要作用[40]。何夙旭等[41]曾报道,嗜水气单胞菌NJ-1与芽孢杆菌R1共培养时,仅能检测出少量的AHLs信号分子,毒力因子相关基因表达量均显著下调;LuxR表达受到抑制,LuxS在36h表达量明显增多,不影响QseB的正常表达,并且指出R1抑制NJ-1毒力因子相关基因表达的原因可能是R1对NJ-1的多种QS系统都有调控作用。已有研究表明,某些物质对毒力因子的产生有一定的抑制作用,如大蒜提取物[42]和栀子苷[43]可以通过QS系统抑制铜绿假单胞菌的毒力因子表达,降低其致病性。是否存在某种物质能够同时调控共培养体系中多种细菌的毒力因子的产生,还有待于进一步的研究。

4.4 对细菌素产生的调控作用

细菌素是细菌为了适应不利的生长条件或者环境变化而产生的一类具有生物活性的蛋白质、多肽,当这些物质积累到一定的数量后对同一生长体系中的其他微生物会产生抑制作用[44]。细菌素合成对条件依赖性很大,如温度、pH、应激、离子强度等都会影响细菌素产生量。当前研究已证明在乳酸乳球菌、粪肠球菌、植物乳杆菌等中存在着调控细菌素合成的QS机制[45]。更有研究表明在进行共培养时,其他种属的细菌会利用QS来调控细菌素的产生菌来合成细菌素。如与特定的革兰氏阳性菌共培养可诱导植物乳杆菌细菌素的合成[46-47]。LactobacillusplantarumJ23与LactobacillusplantarumNC8具有相同的群体感应双组分调节系统[48],当LactobacillusplantarumNC8与特定的革兰氏阳性菌共培养时,可促进细菌素的合成和提高自体诱导物的活性,这对于维持细菌素的合成有很大帮助[49-50]。在液体培养基中对LactobacillusplantarumNC8进行纯培养时是无法合成细菌素的,但当与LactococcuslactisMG1363共培养时,细菌素合成量大大增加[51-52]。在共培养体系中,芽孢杆菌会在与其亲缘关系较近的其他微生物的作用下产生大量细菌素,这种作用与种间群体感应密不可分[53]。由于细菌素可以作为发酵剂的发酵副产物存在于奶制品中,而植物乳杆菌作为诱导菌对乳酸菌产细菌素具有一定的调控作用,并且此调控作用与QS有很大关联。因此研究群体感应对于共培养体系中细菌素的合成具有很大的实际应用价值。

4.5 对分泌蛋白酶的调控作用

具有蛋白水解酶的细菌可以水解食品腐败过程中产生的蛋白质,产生一些小分子物质为自身提供营养同时也会被处于同一环境中的其他微生物所利用[54],产蛋白酶丰富的细菌则会成为食品腐败过程中的优势腐败菌。因此研究多种细菌的生长体系中蛋白酶的变化有助于掌握食品的腐败机制。相关研究表明,群体感应AHLs能够调控铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)和鳗弧菌(Vibrioanguillarum)蛋白水解酶的基因表达[55-56]。刘敏等[57]将芽孢杆菌与嗜热链球菌共培养发现,芽孢杆菌会促进嗜热链球菌的生长,且芽孢杆菌分泌的蛋白酶会水解乳中蛋白质产生寡肽和氨基酸等物质,正是这些物质促进了嗜热链球菌的生长。黄艳等[58]将辅助菌与橙色粘球菌共培养时发现辅助菌有助于粘细菌产生次级代谢产物,而产生这种状况的原因可能是由于共培养的微生物在生长过程中各自产生的酶类之间有相互协同的作用。本实验室利用从腐败大菱鲆中分离到的两株荧光假单胞菌(PF-04)和嗜水气单胞菌(AH-01)进行共培养时发现,共培养液产胞外蛋白酶的能力均好于这两株菌的纯培养液,说明共培养后两株菌产生了协同作用,当改变两株菌共培养的初始浓度时会产生不同的共生效果。由于PF-04为大菱鲆的优势腐败菌,而AH-01为非优势腐败菌,故本实验将这两株菌进行共培养,目的在于研究共培养体系中非优势腐败菌对优势腐败菌分泌蛋白酶能力的调控作用,进而为延缓食品腐败提供理论依据。

综上所述,群体感应在微生物共培养体系的多个方面都有调控作用,如生物被膜的形成、信号分子的产生、毒力因子的产生、细菌素的合成、蛋白酶的分泌等,且不同种属的细菌之间共培养体系的变化不同。

5 共培养存在的问题与展望

信号分子决定了共培养微生物之间的不同生态行为,充分利用共培养技术可以帮助人类发现更多新的种间信号分子。对于共培养中群体感应现象的研究可以结合代谢组学、基因组学和蛋白质组学技术。虽然科学家已经对部分菌株共培养体系中的QS机制有了初步的认识与研究,但是到目前为止还有许多问题亟待解决。比如共培养体系中目标菌通过什么方式感知环境中其他菌株产生的信号分子？如何激发自身及其他菌株的诱导机制？具体是哪一类信号分子产生的作用等。

现在大多数研究只限于两种不同种属的细菌之间,对于三种或三种以上种属的细菌同时进行共培养的研究还未曾见报道,未来要致力于群体感应在三种以上细菌的培养体系的研究;对于共培养体系中群体感应调控的其他因子如群集泳动、嗜铁素的产生以及质粒的结合转移等也有待于探索;且目前对于共培养体系的设立大多是利于细菌生长的环境条件,对于极限条件下(环境胁迫)对共培养体系中群体感应的变化值得研究;在共培养的不同阶段检测体系中产生的信号分子种类及各类型信号分子的含量变化,有助于了解共培养时期信号分子等相关指标的动态变化规律。

综上所述,我们要对微生物的共培养进行多角度、多层次、全方位的研究,为进一步了解共培养机理及群体感应在共培养中的作用提供理论基础。

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Research progress of quorum sensing phenomenon in microorganisms co-culture system

LI Jian-rong1,GUO Jing-wen1,LI Ting-ting2,3,*

(1.Liaoning Provincal Key Laboratory of Food Safety,Food Science Research Institute,Bohai University,Jinzhou 121013,China; 2.College of Life Science,Dalian Nationality of University,Dalian 116600,China; 3.College of Food Science,Southwest University,Chongqing 400715,China)

The method,classification,development,application of microbial co-culture were introduced,and the effects of co-culture of different species were summarized.Microbial co-culture system was regulated not only by the collaborative metabolism,but also by quorum sensing in microbial cultures. Compared with the pure culture,biofilm formation,signaling molecules,virulence factors of production,bacteriocin synthesis and secretion of extracellular protease of co-culture system were different. The research of action mechanism of quorum sensing would improve further development and application of cultivation technology.

microorganisms;co-culture;quorum sensing;synergy metabolism

2016-06-24

励建荣(1964-)，男，博士，教授，主要从事水产品和果蔬贮藏加工，食品安全方面的研究，E-mail：lijr6491@163.com。

*通讯作者:李婷婷(1978-)，女，博士，副教授，主要从事水产品贮藏加工及质量安全方面的研究，E-mail：tingting780612@163.com。

国家自然科学基金(31301572，31301418)；中国博士后科学基金(2014M552302)。

TS201.1

A

1002-0306(2016)23-0377-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.23.062