猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP9蛋白的亚细胞定位与功能预测

2016-02-09赵孟孟冯丽丽张二芹马红芳冯松林崔甜甜杨春辉王文佳冯嘉萍张桂红

河南农业科学 2016年12期

赵孟孟，冯丽丽，张二芹，马红芳，冯松林，崔甜甜，杨春辉，王文佳，邢星，张雅，冯嘉萍，张桂红*

(1.河南农业大学牧医工程学院，河南郑州 450002； 2.华南农业大学兽医学院/国家生猪种业工程技术研究中心/广东省动物源性人兽共患病预防与控制重点实验室，广东广州 510642； 3.河南省农业科学院农业经济与信息研究所，河南郑州 450002； 4.河南省舞阳县畜牧局，河南舞阳 462400； 5.河南牧业经济学院制药工程学院，河南郑州 450046； 6.广西钦州保税港区出入境检验检疫局，广西钦州 535008)

赵孟孟1，2，冯丽丽3，张二芹1，马红芳1，冯松林2，崔甜甜2，杨春辉4，王文佳5，邢星6，张雅1，冯嘉萍2，张桂红2*

为了研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)非结构蛋白9(NSP9)的亚细胞定位，并探索NSP9蛋白在PRRSV复制过程中的定位变化，首先预测NSP9蛋白的生物信息学功能，之后将含有NSP9基因的质粒转染Marc-145细胞，并接种PRRSV，通过间接免疫荧光方法检测NSP9蛋白的表达与定位情况。功能预测结果表明，NSP9蛋白内部存在双向核定位序列、酰胺化位点、N-糖基化位点、酪蛋白激酶磷酸化位点、N-豆蔻酰化位点、蛋白激酶C磷酸化位点、细胞结合位点、酪氨酸激酶磷酸化位点、伸展蛋白重复区域、RNA聚合酶结合区域。间接免疫荧光检测结果显示，PRRSV感染之初，NSP9蛋白定位在Marc-145细胞质中，围绕在细胞核附近，随PRRSV感染时间延长，其逐步往细胞核内转移，转移的面积也逐步增多。可见，PRRSV感染会引起NSP9蛋白向核内转移。

猪繁殖与呼吸综合征病毒； NSP9蛋白；真核表达；亚细胞定位

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种引起母猪繁殖障碍和各年龄猪呼吸道症状的高度传染性、接触性传染病。该病呈世界范围流行，在我国1995年被首次报道[1]，2006年大面积暴发[2]，对我国养猪业造成重大的经济损失。PRRSV是一种有囊膜的单股正链RNA病毒，编码10个开放阅读框，包括ORFla、ORFlb、ORF2—ORF7和ORF2a、ORF5a，ORF1a和ORF1b基因约占病毒基因组的80%，均参与病毒复制，其中ORF1b包括编码RNA依赖的RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerase,RdRp)的NSP9基因，RdRp是RNA复制和转录的引擎，其主要功能是在病毒合成RNA的过程中，结合底物参与RNA的合成[3]，并且此酶只在病毒复制时出现，这对PRRS的诊断有重大意义[4]。有报道该蛋白和病毒毒力密切相关[5]，针对NSP9蛋白及其致病分子机制等方面的研究已成为新的研究热点。

许多RNA病毒的结构蛋白在基础研究和应用方面已日趋完善[6]，相比之下，非结构蛋白方面的研究较少，存在许多未知问题，在这些非结构蛋白中，病毒自身编码的RdRp对病毒的复制起关键作用。对RdRp进行研究可以使RNA病毒复制机制得到进一步阐明，并为研制新的抗病毒靶标和诊断试剂提供可能。NSP9蛋白在PRRSV发生中的具体作用尚不清楚，基于该蛋白的信号转导途径和治疗策略还在寻求之中。PRRSV的NSP9蛋白主要由ORF1b编码，保守性很高[7-8]，宿主蛋白膜联蛋白A2、视网膜神经胶质瘤蛋白、DEAD-box RNA解旋酶与该蛋白相互作用促进PRRSV复制[9-13]，因而，将NSP9蛋白作为诊断抗原鉴别PRRSV感染具有重大意义[14-19]。有报道可以在体外获取有活性的与PRRSV同科的马动脉炎病毒(EAV)的NSP9蛋白，并且该蛋白可以从头起始RNA的复制[20]。另有报道，NSP9蛋白可以诱导产生IFN-γ和IL-10[21-22]。

NSP9蛋白和宿主蛋白互相作用，促进病毒复制，抑制该蛋白会抑制病毒的复制，但是PRRSV非结构蛋白NSP9在病毒复制过程中的具体作用缺乏相应研究，NSP9的亚细胞定位以及病毒感染对NSP9的影响尚未见报道。为此，本研究采用生物信息学对NSP9蛋白的功能进行预测，并对其亚细胞定位进行探究，旨在为PRRSV致病机制研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 细胞和培养基 Marc-145细胞由农业部兽用疫苗创制重点实验室保存，DMEM细胞培养基、胎牛血清购自Gibco公司。

1.1.2 菌株和质粒大肠杆菌DH5α感受态细胞购自天根生物科技有限公司(北京)，pIRES2-EGFP-NSP9质粒由农业部兽用疫苗创制重点实验室保存。

1.1.3 主要试剂与仪器去内毒素质粒提取试剂盒为OMEGA公司产品，聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)、4%多聚甲醛、4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)购自天根生化科技(北京)有限公司，裂解液RIPA购自北京百泰克生物技术有限公司。PRRSV NSP9蛋白单克隆抗体由农业部兽用疫苗创制重点实验室保存，辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗鼠IgG购自北京博奥森生物技术有限公司，罗丹明(Rhodamine)标记的山羊抗鼠IgG购自武汉三鹰生物技术有限公司，脱脂奶粉购自美国BD公司。

1.2 方法

1.2.1 NSP9的核定位、核输出信号、结构功能域分析利用信息学分析网站http://nls-mapper.iab.keio.ac.jp/cgi-bin/NLS_Mapper_y.cgi预测NSP9蛋白的核定位序列，http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNES/预测其核输出序列， http://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan预测其功能域。

1.2.2 pIRES2-EGFP-NSP9质粒的抽提、转染将pIRES2-EGFP-NSP9质粒转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，通过菌液PCR筛选出阳性克隆，送往上海立菲生物科技有限公司测序。序列测定为阳性的菌液，参照OMEGA去内毒素质粒提取试剂盒的说明书进行去内毒素重组质粒的抽提。

Marc-145细胞在含10%胎牛血清的DMEM培养基中生长至60%左右，用Invitrogen公司的脂质体Lipofectamine 2000进行转染。

1.2.3 转染细胞的Western blot鉴定转染48 h的细胞样品弃去上清，之后用RIPA裂解液进行裂解，取上清进行SDS-PAGE分析，电泳结束后采用半干转膜方法，在15 V电压下转移60 min， 5%脱脂奶粉封闭1 h，NSP9蛋白单克隆抗体(1∶500稀释)孵育过夜，加入用TBST缓冲液(TBS+0.2%Tween-20)按1∶5 000稀释的HRP标记山羊抗鼠 IgG孵育1 h，之后ECL化学发光拍照记录。

1.2.4 间接免疫荧光(IFA)鉴定NSP9在细胞中的表达转染后的 Marc-145细胞继续培养48 h，经观察可用作IFA检测。每孔加入200 μL的4%多聚甲醛固定，加入100 μL 0.25%的Triton X-100，用5%的脱脂牛奶封闭1 h，每孔加200 μL按1∶500倍稀释的PRRSV NSP9蛋白的单克隆抗体，孵育后每孔加入200 μL按1∶100稀释的罗丹明标记的山羊抗鼠IgG，DAPI染色5 min,最后置于免疫荧光显微镜下观察。

1.2.5 PRRSV感染对NSP9蛋白在Marc-145细胞中定位的影响待Marc-145细胞长至60%左右进行转染，24 h后以MOI为1的病毒剂量接毒，分别在接毒之后6 h、12 h、24 h、48 h进行间接免疫荧光鉴定，方法参照1.2.4。

2 结果与分析

2.1 生物信息学分析结果

核定位分析表明，有3段序列可以在细胞质和细胞核之间穿梭，分别为RLVRKYLFAHVGKCPPVHRPSTYPAKNSMA、VTKRGGLSSGDPITSVSNTIYSLVIYAQH、YFKSGHPHGLLFLQDQLKFEDMLKVQPLI。核输出序列预测结果表明无核输出序列。功能预测结果表明，NSP9蛋白内部存在双向核定位序列、酰胺化位点、N-糖基化位点、酪蛋白激酶磷酸化位点、N-豆蔻酰化位点、蛋白激酶C磷酸化位点、细胞结合位点、酪氨酸激酶磷酸化位点、伸展蛋白重复区域、RNA聚合酶结合区域。

2.2 重组表达质粒pIRES2-EGFP-NSP9 在Marc-145细胞中的表达结果

将鉴定正确的重组表达质粒转染生长状况良好的Marc-145细胞，48 h后荧光显微镜观察，绿色荧光非常明显，表明转染的重组质粒得到了稳定的表达(图1)。

图1 pIRES2-EGFP-NSP9转染Marc-145细胞荧光显微镜观察结果

将转染重组质粒后的Marc-145细胞进行裂解，经Western blot鉴定，结果表明，在近90 ku处出现目的蛋白，与预期一致，说明NSP9蛋白得到了正确表达(图2)。

M.蛋白质Marker； 1.pIRES2-EGFP-NSP9转染结果;2.pIRES2-EGFP转染结果

将转染48 h后的Marc-145细胞经过IFA检测，可观察到较强的红色荧光，其代表表达在细胞上的NSP9蛋白，根据细胞核位置与红色荧光的相对位置，NSP9蛋白主要定位在细胞质中(图3)。

A.NSP9蛋白； B.DAPI染色； C.叠加

2.3 PRRSV感染后NSP9位置的变化

从图4可以看出，初始NSP9蛋白处于细胞质内，围绕细胞核。PRRSV感染后，随着时间的推移，NSP9蛋白逐步往细胞核内转移，转移的面积也逐步增多。

A.NSP9蛋白； B.DAPI染色； C.叠加

3 结论与讨论

通常病毒结构蛋白与非结构蛋白的提取较为困难，因此，将外源基因插入真核表达载体转染真核细胞成为表达此类蛋白质比较有效的方法之一。本研究利用pIRES2-EGFP载体表达NSP9蛋白，间接免疫荧光试验结果表明，NSP9蛋白主要定位于细胞质，细胞核未见表达，这与软件预测结果保持一致。病毒感染细胞之后，随着病毒复制，NSP9蛋白逐步往细胞核中转移，并且转移面积逐步增多。往细胞核内转移的原因，可能是病毒在细胞核内组装，NSP9蛋白参与病毒的组装与成熟，在胞浆和胞核之间充当运输载体及进行信号转导。NSP9蛋白在胞浆和胞核之间介导通路的调控中是否扮演不同的角色还需验证，软件预测NSP9蛋白含有双向核定位序列，可能是这些序列介导病毒感染之后进入细胞核，本试验结果验证了软件预测结果。NSP9蛋白入核之后如何调节细胞因子的变化，是否引起各个通路的变化，在细胞质内以及细胞核内如何与宿主蛋白相互作用，均需要进一步的试验验证。此外，NSP9蛋白入核前后如何调节宿主的免疫反应，这种免疫反应是否与病毒逃逸免疫系统以及病毒的毒力相关都是下一步要解决的问题。软件预测结果表明，NSP9蛋白存在一些核定位序列，其是否参与免疫调节，以及是否与毒力相关也是需要研究解决的问题。

本研究结果为NSP9蛋白参与病毒复制研究提供了基础数据，填补该研究的未知领域，为抗病毒药物研发及受体相互作用研究提供新的思路和线索[23-26]，为下一步研究NSP9蛋白在病毒复制过程中的位置变化所带来的信号转导通路的变化、探索该蛋白的免疫调控机制以及该蛋白与病毒毒力关系奠定了基础。

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Subcellular Localization Analysis and Function Prediction of PRRSV NSP9 Protein

ZHAO Mengmeng1，2,FENG Lili3,ZHANG Erqin1,MA Hongfang1,FENG Songlin2,CUI Tiantian2,YANG Chunhui4,WANG Wenjia5,XING Xing6,ZHANG Ya1,FENG Jiaping2,ZHANG Guihong2*

(1.College of Animal Science and Veterinary Medicine,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002,China; 2.Key Laboratory of Zoonosis Prevention and Control of Guangdong Province/National Engineering Research Center for Breeding Swine Industry/College of Veterinary Medicine,South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China;3.Institute of Agricultural Economics and Information,Henan Academy of Agricultural Sciences,Zhengzhou 450002,China;4.Wuyang County Animal Husbandry Bureau,Wuyang 462400,China; 5.School of Pharmaceutical Engineering,Henan University of Animal Husbandry and Economy,Zhengzhou 450046,China; 6.Guangxi Qinzhou Free Trade Port Area Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau,Qinzhou 535008,China)

This study aimed to confirm the subcellular localization of NSP9 protein and verify whether PRRSV infection could affect its localization.The biological characters was predicted by softwares.Plasmids containingNSP9 gene were transfected into Marc-145 cells,and Marc-145 cells were infected with PRRSV. Indirect immunofluorescence assay(IFA) was used to detect its localization.The results of functional prediction showed that NSP9 protein had two-way nuclear localization sequence,amidation site,a casein kinase phosphorylation site,N-glycosylation site,N-myristoylation site,protein kinase C phosphorylation site,a cell binding site,a tyrosine kinase phosphorylation site,a stretch protein repeat region,and an RNA polymerase binding domain.The results of IFA showed that NSP9 protein was located in the cytoplasm in Marc-145 cells.After PRRSV infection,NSP9 protein gradually transfer to the nucleus,and the area also gradually increased.It demonstrated that PRRSV infection changed the localization of NSP9 protein.

PRRSV; NSP9 protein; eukaryotic expression； subcellular localization

2016-07-16

国家自然科学基金项目(31272564)；公益性行业(农业)科研专项(201203039)；国家生猪现代农业产业技术体系项目(CARS-36)；国家重点研发计划课题(2016YFD0500707)

赵孟孟(1986-)，男，河南汝州人，在读博士研究生，研究方向：猪繁殖与呼吸综合征病毒的致病机制。 E-mail: zhaomengmeng502@163.com

*通讯作者：张桂红(1968-)，女，黑龙江哈尔滨人，教授，博士，主要从事动物传染病研究。

时间：2016-11-25 14:24:33

S855.3

1004-3268(2016)12-0138-05

网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/41.1092.S.20161125.1424.032.html