scFv-LAA0融合蛋白的制备及对人肺腺癌细胞H460、小鼠肺腺癌增殖抑制作用观察

杨光勇，郭海涛，刘茜明，何光志

(贵阳中医学院，贵阳550002)

scFv-LAA0融合蛋白的制备及对人肺腺癌细胞H460、小鼠肺腺癌增殖抑制作用观察

杨光勇，郭海涛，刘茜明，何光志

(贵阳中医学院，贵阳550002)

目的 制备重组抗白介素4受体(IL-4R)单链抗体基因与竹叶青蛇毒L-氨基酸氧化酶(LAAO)的融合蛋白(scFv-LAAO融合蛋白)，并观察其对人肺腺癌细胞H460、小鼠肺腺癌增殖抑制作用。方法 ①采用重叠延伸PCR技术将抗IL-4R单链抗体与竹叶青蛇毒LAAO基因连接成scFv-LAAO融合基因，构建重组质粒pET28a-scFv-LAAO，转染BL21(DE3)原核表达菌，诱导表达scFv-LAAO融合蛋白，用SDS-PAGE法检测scFv-LAAO融合蛋白的分子量，用Western blotting法检测scFv-LAAO融合蛋白的His-tag表达。②设空白对照组、环磷酰胺组和融合蛋白组(包括高、中、低剂量融合蛋白组)，分别用培养基、2.0 mg/mL环磷酰胺及4.0、2.0、1.0 mg/mL的scFv-LAAO融合蛋白培养人肺腺癌H460细胞，用MTT法测算环磷酰胺组和高、中、低剂量融合蛋白组细胞增殖抑制率。取75只小鼠，建立荷肺腺癌动物模型，随机分为空白对照组、环磷酰胺组和融合蛋白组(包括高、中、低剂量融合蛋白组)，分别腹腔注射生理盐水、0.1 mL/10 g体质量的环磷酰胺和100、50和20 mg/kg的scFv-LAAO融合蛋白，1次/d，连用10 d后停药，停药7 d后称量各组小鼠瘤重，计算环磷酰胺组和高、中、低各剂量融合蛋白组抑瘤率；同时统计存活时间。结果 scFv-LAAO融合基因长度2 000～3 000 bp。用融合基因转染BL21(DE3)原核表达菌后，将细菌裂解从裂解液中分离出的蛋白分子量86 kD，与scFv-LAAO融合蛋白分子量相符，且用Western blotting法在分离到的蛋白中检出scFv-LAAO融合蛋白组氨酸标签。环磷酰胺组和高剂量融合蛋白组人肺腺癌H460细胞增殖抑制率、小鼠抑瘤率和生存时间相比，P均>0.05；环磷酰胺组和高剂量融合蛋白组H460细胞增殖抑制率、小鼠抑瘤率和生存时间高于低、中剂量融合蛋白组，P均<0.05；低剂量融合蛋白组H460细胞增殖抑制率、小鼠抑瘤率和生存时间低于中剂量融合蛋白组，P均<0.05。结论 成功制备scFv-LAAO融合蛋白。scFv-LAAO融合蛋白可以抑制人肺腺癌细胞H460、小鼠肺腺癌增殖。

抗白介素4受体单链抗体；竹叶青蛇毒LAAO；白细胞肺肿瘤；肺腺癌；细胞增殖

竹叶青蛇毒L-氨基酸氧化酶(LAAO)对多种癌细胞具有直接杀伤和诱导调亡的作用，但对正常细胞也有杀伤作用[1]；白介素4受体(IL-4R)在癌细胞上特异性过度表达，是抗癌药物作用的良好靶标[2]。构建抗IL-4R单链抗体与竹叶青蛇毒LAAO的融合蛋白，有助于实现竹叶青蛇毒LAAO对肿瘤细胞的特异性杀伤。目前尚未有构建抗IL-4R单链抗体与竹叶青蛇毒LAAO的融合蛋白，并将其用于靶向治疗肺腺癌的相关报道。本研究采用分子生物学手段将编码抗IL-4R单链抗体片段基因(scFv)和编码竹叶青蛇毒LAAO的基因构建成复合基因scFv-LAAO，插入载体pET-28a使BL21(DE3)原核表达菌表达融合蛋白，并观察scFv-LAAO融合蛋白对人肺腺癌细胞H460、小鼠肺腺癌增殖抑制作用。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 E.coli BL21(DE3)由本实验室保存。pET-28a由上海英骏生物公司提供。Anti-6×His tag抗体 (HRP)与Rabbit anti-mouse antibody购自Abcam公司。卡那霉素购自北京索莱宝生物科技有限公司，XhoⅠ内切酶与EcoRⅠ内切酶购自美国Thermo Scientific公司。SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、考马斯亮蓝R250与ECL Plus荧光检测试剂ECL超敏发光液、蛋白Marker PR1800、4×蛋白上样缓冲液 购自北京索莱宝生物科技有限公司。PVDF膜购自Millipore公司；健康昆系小鼠(4～6周龄、体质量18～20 g、雄性、清洁级)和人肺腺癌细胞株H460购自中科院生物化学与细胞生物学研究所。

1.2 scFv-LAAO融合蛋白的制备

1.2.1 竹叶青蛇毒LAAO基因设计与合成 竹叶青蛇毒LAAO基因序列已在之前的实验中得到，见参考文献[3]，在LAAO序列5′端加上带有一段与抗IL-4R单链抗体scFv基因序列相同的重叠序列(40 bp)以及一段连接肽基因，另外在重叠序列-linker-LAAO基因序列的3′端加上XhoⅠ酶切位点。

1.2.2 引物设计 设计引物F1和引物F2去除抗IL-4R单链抗体scFv基因序列的Xho I酶切位点；设计引物F1和F3，通过重叠延伸RCR(SOE-PCR)技术连接抗IL-4R单链抗体(scFv)与竹叶青蛇毒LAAO基因成融合基因scFv-LAAO。委托上海英俊生物公司合成的引物序列如下：引物F1：5′-GAATTCATGGCCCAGGTCCAGCT-3′；引物F2：5′-GCTGAAACGGGCGGCCGCAGAA-3′；引物F3：5′-ATGACGATGAACTTTAACTCGAG-3′。

1.2.3 scFv与竹叶青蛇毒LAAO基因的连接 参考文献[4]方法制备scFv基因，其5′端带有EcoRⅠ酶切位点。与LAAO连接之前用引物F1、F2去除XhoⅠ酶切位点，反应体系参照参考文献[5]。scFv与LAAO的SOE-PCR反应体系参照参考文献[5]，PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳并用胶回收试剂盒回收基因片段。

1.2.4 pET-28a载体/scFv-LAAO基因片段的双酶切与目的片段回收 反应体系参照参考文献[5]，双酶切体系按照限制性内切酶XhoⅠ与EcoRⅠ说明书操作。取酶切得到的scFv-LAAO基因片段进行1%琼脂糖凝胶电泳分别回收目的片段。按照同样方法对pET-28a载体进行双酶切和回收目的片段。

1.2.5 重组质粒pET-28a-scFv-LAAO的构建与转化 按照快速DNA连接试剂盒说明书连接pET-28a-scFv-LAAO融合基因，反应体系参照其说明书。参照《分子克隆实验指南》[6]，将pET-28a重组质粒scFv-LAAO导入E.coli BL21(DE3)感受态细胞，复苏后进行培养。

1.2.6 重组质粒酶切鉴定鉴定 挑取10个单菌落用装有15 mL的TB培养液(卡那霉素50 μg/mL)的100 mL培养瓶中，于37 ℃环境下震荡培养至OD600为0.6～0.8，用高纯质粒小量制备试剂盒提取质粒。先后用限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ对该质粒进行双酶切鉴定；将成功酶切的质粒送上海英骏生物公司测序，利用DNA Star7.10软件对测序结果进行蛋白质氨基酸序列翻译，并对翻译结果进行预测分析。

1.2.7 重组毒素scFv-LAAO抗体蛋白的诱导表达 以参考文献[7,8]及Novagen公司的pET系统操作手册为指导。挑取平板上的单个菌落接种至装有10 mL的TB培养基(含卡那霉素50 μg/mL)的50 mL锥形瓶中于37 ℃ 振荡培养至OD600为0.4～0.6， 加入终浓度为1 mmol/L的IPTG，于37 ℃ 快速振荡培养诱导重组蛋白表达3 h。

1.2.8 scFv-LAAO融合蛋白鉴定 以参考文献[8]为指导，将诱导重组蛋白表达3 h的菌体裂解并离心，将上清液和沉淀溶解液分别进行SDS-PAGE分析。确定为可溶性表达后，取100 μL上清液取加入20 μL的4×蛋白上样缓冲液(含DTT)混合，于沸水中加热使蛋白变性，冷却至常温后进行离心，取上清液用SDS-PAGE方法分离样品中的蛋白。进行考马斯亮蓝染色检测所得蛋白分子量并用Western blotting法检测 scFv-LAAO融合蛋白组氨酸标签。

1.3 不同浓度scFv-LAAO融合蛋白培养的人肺腺癌H460细胞增殖情况观察 采用MTT法。用低血清RPMI1640 培养基将培养的人肺腺癌细胞株H460稀释至(1～2)×105/mL，每孔 100 μL接种于 96 孔培养板，在5%的CO2浓度培养箱中于37 ℃培养至细胞贴壁后弃培养液。设空白对照组、环磷酰胺组和融合蛋白组(包括高、中、低剂量融合蛋白组，分别加入含scFv-LAAO融合蛋白RPMI1640培养基用低终浓度为4.0、2.0、1.0 mg/mL)。空白对照组加入等量的RPMI1640 培养基。每组每个浓度设3个平行孔，培养4 h取出培养板，每孔加入50 μL的MTT(1 mg/mL), 4 h后弃MTT，加入DMSO 100 μL/孔溶解formazan结晶。环磷酰胺组用药剂量终浓度为2.0 mg/mL，处理方法同融合蛋白组。用酶标仪检测各组每孔的OD490值，根据OD490值各组增殖抑制率。增殖抑制率(%)=[(对照组OD值-药物作用组OD值)/对照组OD值] ×100%。

1.4 不同浓度scFv-LAAO融合蛋白腹腔注射后荷人肺腺癌小鼠的抑瘤率和存活时间观察 将75只健康昆系小鼠动物随机分为空白对照组、环磷酰胺组和融合蛋白组(包括高、中、低剂量融合蛋白组)，每组15只。将人肺癌H460细胞复苏后进行培养，调整活细胞数至1×106/mL，在小鼠右腋下注射接种0.2 mL/只，3周后荷瘤肺癌小鼠出现肿块。高、中、低剂量融合蛋白组小鼠腹腔注射scFv-LAAO融合蛋白100、50和20 mg/kg；环磷酰胺组腹腔注射环磷酰胺10 mg/kg，用量为0.1 mL/10 g体质量。各组每天给药1次，连续10 d。停药第7 d后，每组处死5只小鼠，剖取瘤块进行称重。肿瘤抑制率(%)=(对照组平均瘤重-给药组平均瘤重)/对照组平均瘤重×100%。余下小鼠停药后，继续观察小鼠存活天数。

2 结果

2.1 scFv-LAAO融合蛋白的构建结果 对通过SOE-PCR连接的scFv-LAAO基因进行琼脂糖凝胶电泳，结果在2 000～3 000 bp有一条明显的条带，与预期2 355 bp长度相似，表明scFv与LAAO两段基因连接成功。用限制性内切酶XhoⅠ和EcoRⅠ对重组质粒进行双酶切鉴定，1%琼脂糖凝胶进行电泳后在2 000～3 000 bp有一条明显的条带，符合插入的scFv-LAAO片段大小。将成功酶切的质粒送上海英骏生物公司测序，通过Geneious9.1.2软件分析scFv-LAAO序列共计2 355 bp，利用DNA Star7.10软件对测序结果进行蛋白质氨基酸序列翻译，结果scFv-LAAO序列能编码785个氨基酸，蛋白分子量在86 kD左右。考马斯亮蓝染色结果表明分离到的蛋白以可溶性形式表达，分子量为86 kD。Western blotting法检测到分离到的蛋白的scFv-LAAO融合蛋白组氨酸标签。

2.2 各组人肺腺癌H460细胞增殖抑制率比较 环磷酰胺组和低、中、高剂量融合蛋白组人肺腺癌H460细胞增殖抑制率分别为55.29%±0.83%、25.88%±0.57%、52.35%±0.57%、59.41%±0.57%，环磷酰胺组和高剂量融合蛋白组H460细胞增殖抑制率相比，P>0.05；环磷酰胺组和高剂量融合蛋白组H460细胞增殖抑制率高于低、中剂量融合蛋白组，P均<0.05；低剂量融合蛋白组H460细胞增殖抑制率低于中剂量融合蛋白组，P均<0.05。

2.3 各组小鼠的抑瘤率和存活时间比较 环磷酰胺组和低、中、高剂量融合蛋白组小鼠抑瘤率和存活时间见表1。环磷酰胺组和高剂量融合蛋白组小鼠抑瘤率、存活时间相比，P均>0.05；环磷酰胺组和高剂量融合蛋白组抑瘤率、存活时间高于低、中剂量融合蛋白组，P均<0.05；低剂量融合蛋白组抑瘤率、存活时间低于中剂量融合蛋白组，P均<0.05。

表1 环磷酰胺组和低、中、高剂量融合蛋白组小鼠抑瘤率和存活时间比较±s)

3 讨论

将两段基因连接形成新的融合基因最常用的和效果最好的方法为SOE-PCR，这项技术在医学和分子生物学研究等领域得到广泛应用[9～11]。SOE-PCR的主要原理是用PCR方法将两段基因扩增出一段长约40 bp的碱基序列重叠区，再通过两段基因的上、下游引物进行连接与扩增[12～14]。因竹叶青蛇毒LAAO基因是由人工合成的，故在LAAO基因的5′端设计了与scFv的3′端的重叠区，作为两段基因的连接桥梁，同时在基因序列3′端加上了XhoⅠ酶切位点，还加上了一条连接肽保证蛋白形成时正确空间折叠。以上修改简化了SOE-PCR的操作过程和引物设计，其中40 bp碱基序列重叠区的长度有利于两段基因的成功连接[14]。scFv对肿瘤组织的穿透力强，可以与其他效应分子连接成抗肿瘤融合蛋白等特点，是保持抗体亲和性和特异性的最小功能性抗体片段[15,16]，广泛应用于医学和生物技术研究领域。本研究结果显示，IL-4R单链抗体与scFv-LAAO融合基因长度2 000～3 000 bp。用融合基因转染BL21(DE3)原核表达菌后，从细菌培养液上清中分离出的蛋白分子量86 kD，与scFv-LAAO融合蛋白分子量相符，且用Western blotting法在分离到的蛋白中检出scFv-LAAO融合蛋白组氨酸标签。表明我们成功将scFv与竹叶青蛇毒LAAO基因通过SOE-PCR技术进行连接，用pET28a载体搭载scFv-LAAO融合基因，最后利用BL21(DE3)表达菌表达出了scFv-LAAO融合蛋白。

研究表明，蛇毒中的LAAO是一种有潜力的抗肿瘤制剂，将其开发为一种新型的抗肿瘤药具有广阔的临床应用前景[3,17]。张玉洁等[18]分离纯化竹叶青蛇毒LAAO，发现其具有诱导癌细胞凋亡和抗菌作用；重组竹叶青蛇毒LAAO对肿瘤细胞有显著的增殖抑制殖作用[1]。然而，竹叶青蛇毒LAAO对肿瘤杀伤作用没有选择性。而IL-4R在癌细胞上特异性过度表达，是抗癌药物的良好靶标[2]。因此，本研究结合两者的特性，制备了scFv-LAAO融合蛋白，并观察其体内外抗癌作用。本研究结果显示，环磷酰胺组和高剂量融合蛋白组H460细胞增殖抑制率、小鼠抑瘤率和生存时间高于低、中剂量融合蛋白组；低剂量融合蛋白组H460细胞增殖抑制率、小鼠抑瘤率和生存时间低于中剂量融合蛋白组。表明scFv-LAAO融合蛋白在体内外均有抗肺腺癌作用。笔者认为scFv-LAAO融合蛋白的抗癌机制为，通过其抗IL-4R单链抗体svFv部分选择性结合肿瘤细胞上的IL-4R，并通过竹叶青蛇毒LAAO部分发挥杀伤肿瘤细胞的作用。scFv-LAAO融合蛋白具有一定抗肿瘤作用，可进一步研究其作用机制与效果，开发新型的抗癌药或诊断试剂。scFv-LAAO融合蛋白相比目前市场上的单克隆抗体，对抗原的亲和力高，分子量小,细胞膜穿透力强，易渗透肿瘤组织，抗原性弱，排异反应小。本研究为开发利用scFv-LAAO融合蛋白提供实验依据，为进一步研制新型的抗肿瘤药物打下了良好的基础。

[1] 何光志, 田维毅, 王安宇, 等. 竹叶青蛇毒L-氨基酸氧化酶的表达载体的构建及重组蛋白抗肿瘤的研究[J]. 湖南师范大学自然科学学报, 2012, 35(4):59-63.

[2] Hosoyama T, Aslam MI, Abraham J, et al. IL-4R drives dedifferentiation, mitogenesis and metastasis in rhabdomyosarcoma[J]. Clin Cancer Res, 2011, 17(9):2757-2766.

[3] 何光志,邓树轩,田维毅,等.竹叶青蛇毒L-氨基酸氧化酶(LAAO)基因的克隆及序列分析[J].黑龙江畜牧兽医,2012,10(19):18-21.

[4] 杨光勇，郭海涛，刘茜明，等.重组白细胞介素4受体(IL-4R)噬菌体单链抗体库构建及筛选[J].细胞与分子免疫学杂志，2016,6(32):829-833.

[5] 王晓云，雷志强，王邵华，等.重叠延伸PCR法合成栀子两个糖基转移酶基因[J].生物技术，2015,25(5):451-457.

[6] J.萨姆布鲁克.分子克隆实验指南[M].3版.北京:科学出版社,2002：98-99.

[7] 傅生芳,朱传凤,姜英,等.人呼吸道合胞病毒截短F1重组蛋白包涵体的制备、纯化和复性[J].微生物学免疫学进展,2015,43(3):21-25.

[8] 李振,崔凡,李良怿,等.耐甲氧西林金黄色葡萄球菌细胞膜20肽重组蛋白SA0587的表达和鉴定[J].细胞与分子免疫学杂志,2016，32(9)：1231-1233.

[9] Karkhane AA, Yakhchali B, Ferdous R, et al. A nested-splicing by overlap extension PCR improves specificity of this standard method[J]. Iran J Bio Technol , 2015,13(2):56-59.

[10] Tan L, Chen H, Yu S, et al. A SOE-PCR method of introducing multiple mutations into Mycoplasma gallisepticum neuraminidase[J]. J Micrlbiol Meth, 2013,94(2):117-120.

[11] Pritee S, Mansi P, Monica J, et al. Characterization and expression of codon optimized soybean phytase gene in E. coli[J]. Ind J Biochem Bio, 2013,50(6):537-547.

[12] Zhang X, Huang Z, Wang L, et al. Construction of a single chain variable fragment antibody (scFv) against carbaryl and its interaction with carbaryl[J]. Biochemistry, 2015,80(5):640-646.

[13] Yi L, Cheng S. Preparation and identification of a single-chain variable fragment antibody against canine distemper virus[J]. Monl Antibod Immunod Immunoth, 2015,34(4):228-232.

[14] Nie X, Zhang L, Hu Z, et al. Human neutrophil peptide 3 could be functionally expressed in rhodobacter sphaeroides[J]. Acta Bioch Pol, 2015,62(2):259-263.

[15] 郭海涛,杨光勇,何光志.单链抗体的研究进展及其应用[J].黑龙江畜牧兽医,2015,7(13):76-79.

[16] Laginha KM, Moase EH, Yu N, et al. Bioavailability and therapeutic efficacy of HER2 scFv-targeted liposomal doxorubicin in a murine model of HER2-overexpressing breast cancer[J]. J Drug Target, 2015,16(7):605-610.

[17] 金夕琳,张洁,江海龙,等.蛇毒毒素的抗肿瘤作用及其在医药领域的应用[J].药学实践杂志,2015(6):502-504.

[18] 张玉洁,陈克平,李文辉,等.竹叶青蛇毒L-氨基酸氧化酶的纯化、诱导细胞凋亡和抗菌作用[J].天然产物研究与开发,2006,18(1):33-37.

Preparation of scFv-LAAO fusion protein and its anti-proliferative effect on human lung adenocarcinoma H460 cells and mouse lung adenocarcinoma cells

YANGGuangyong,GUOHaitao,LIUQianming,HEGuangzhi

(GuiYangCollegeofTraditionalChineseMedicine,Guiyang550002,China)

Objective To prepare the fusion protein of recombinant anti-interleukin-4 receptor (IL-4R) single antibody gene and Trimeresurus stejnegeri venom L-amino acid oxidase (LAAO) gene (scFv-LAAO fusion protein), and then to observed its anti-proliferative effect on human lung adenocarcinoma H460 cells and mouse pulmonary adenocarcinoma cells. Methods ① We connected IL-4R scFv gene and LAAO gene to make the scFv-LAAO fusion gene by splicing overlapping extension PCR (SOE-PCR), constructed the pET28a-scFv-LAAO recombinant plasmid, and then used the plasmid to transfect the BL21(DE3) prokaryotic expression bacterium and induced it to express the scFv-LAAO fusion protein. The molecular weight of scFv-LAAO fusion protein was detected by SDS-PAGE, and the expression of His-tag of scFv-LAAO fusion protein was detected by Western blotting. ② Setting the control group, cyclophosphamide group and fusion protein group (including high-dose group, medium-dose group and low-dose group), and in the six groups we separately cultured the human lung adenocarcinoma cells H460 with cell culture medium, cyclophosphamide (2.0 mg/mL), and scFv-LAAO fusion protein (4.0, 2.0 and 1.0 mg/mL). We detected and calculated the inhibition rates of cell proliferation of the cyclophosphamide group and fusion protein group (high-dose group, medium-dose group and low-dose group) by MTT. Seventy-five mice were selected to establish the animal models of lung adenocarcinoma, and then were randomly divided into the control group, cyclophosphamide group and fusion protein group (including high-dose group, medium-dose group and low-dose group), and the six groups were separately given physiological saline, cyclophosphamide (0.1 mL/10g), scFv-LAAO fusion protein (100, 50 and 20 mg/kg) through intraperitoneal injection once per day for 10 days. Seven days after drug withdrawal, we weighed the mice of each group, calculated the anti-tumor rate of cyclophosphamide group, high-dose group, medium-dose group and low-dose group of fusion protein, at the same time we recorded the survival time of statistics. Results The length of scFv-LAAO fusion gene was 2 000～3 000 bp. After the prokaryotic expression bacterium BL21(DE3) was transfected by the fusion gene, the fusion protein scFv-LAAO was extracted from the supernatant of bacteria lysate, and its molecular weight was about 86 kD, which coincided with scFv-LAAO fusion protein, and the His-tag of scFv-LAAO fusion protein was detected by Western bloting. No significant difference was found in the cell proliferation inhibition rate, anti-tumor rate and survival time of human lung adenocarcinoma H460 cells between the cyclophosphamide group and high-dose fusion protein group (allP>0.05). The cell proliferation inhibition rate, anti-tumor rate and survival time of human lung adenocarcinoma H460 cells of the cyclophosphamide group and high-dose fusion protein group was higher than that of the medium-dose and low-dose fusion protein groups (allP<0.05). Meanwhile, the cell proliferation inhibition rate, anti-tumor rate and survival time of the low-dose group was lower than that of the medium-dose group (allP<0.05).Conclusion The scFv-LAAO fusion protein is successfully prepared, and ScFv-LAAO fusion protein can inhibit the proliferation of human lung adenocarcinoma H460 cells and mouse lung adenocarcinoma cells.

anti-interleukin-4 receptor single antibody; Trimeresurus stejnegeri venom L-amino acid oxidase; lung neoplasms; pulmonary adenocarcinoma; cell proliferation

贵州省社会发展科技攻关项目(20113020)；贵州省科学技术基金资助项目(20122075)；贵州省委组织部高层次人才科研条件

特助经费资助项目(TZJF201128);贵州省教育厅创新群体重大研究项目(201636)。

杨光勇(1988-)，男，硕士，助理实验师，主要研究方向为分子生物学。E-mail: 768305874@qq.com

简介：何光志(1977-)，男，博士，教授，硕士生导师，主要研究方向为中西医结合基础。E-mail: heguangzhi7711@sina.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.47.002

R392.11;Q789;Q939.48

A

1002-266X(2016)47-0004-05

2016-07-11)