功能性生物分子对纳米材料的修饰及影响

刘宇炜， 郭 卓

(沈阳化工大学 材料科学与工程学院， 辽宁 沈阳 110142)



功能性生物分子对纳米材料的修饰及影响

刘宇炜， 郭 卓

(沈阳化工大学 材料科学与工程学院， 辽宁 沈阳 110142)

利用功能性生物分子牛血清蛋白，通过不同方法对介孔二氧化硅纳米粒子进行功能化，并观察其对药物释放行为的影响.结果发现：通过加热变性方式来修饰牛血清蛋白时，牛血清蛋白能在介孔二氧化硅纳米颗粒表面形成蛋白外壳，并抑制了在不同pH值环境下的药物释放行为.而通过静电作用修饰牛血清蛋白时，发现蛋白分子能够吸附在介孔二氧化硅的表面，并促进了药物释放行为对环境pH值变化的响应.

功能性生物分子； 牛血清蛋白； 介孔二氧化硅； 药物释放

随着生物医学的不断进步，癌症治疗手段正从单一的化疗手段逐步发展为多元手段，其中纳米材料起到了重要的推动作用.研究者们通过选取的反应物，控制反应条件，制备出了具有各种功能和尺寸的纳米材料.Tasciotti E等人通过合成不同尺寸形貌以及孔径的介孔二氧化硅粒子，成功将其作为多级运载系统应用于生物成像与治疗[1]. Huang Xiaohua等人通过制备Au纳米棒，利用其在近红外区具有等离子体共振效应这个特性，成功将其应用于癌细胞成像与光热治疗中[2].Hessel C M等人通过制备在近红外区具有光热转换性能的 Cu2-xSe纳米颗粒，成功开启了半导体纳米材料在生物体中光热治疗的应用[3].功能性生物纳米材料正凭借着其优异的性能，不断促进生物医学的发展.但是，遗憾的是这些材料并不能直接作用于生物体内.

由于生物分子拥有良好的生物相容性，并带有丰富的化学基团，功能性生物分子这一概念逐渐被研究者们先后提出.利用生物分子功能化纳米材料，弥补材料原有的生物应用缺陷并提高其相关性能，已成为一项极具应用潜力的研究.生物相容性、分散性、特异性等都是纳米材料作用于体内癌细胞必不可少的性质.但这些具有特殊功能的纳米材料在生物体内癌症治疗应用方面存在缺陷，因此，功能化这一概念开始被研究者们提出，研究者将纳米材料进行了功能化.通过不同方法在材料表面修饰上具有特殊功能的分子，同时提高其性能.Liu Z等人以共价键的方式成功在氧化石墨烯上修饰了聚乙二醇，使原本无法分散于血清中的氧化石墨烯能够很好地分散于血清之中[4].Chen H Y等人利用牛血清蛋白在Au纳米簇周围包裹了一层功能性蛋白分子层，不仅弥补了Au纳米簇易团聚的缺陷，还提供了多种官能团，同时在蛋白分子上进一步修饰上了叶酸，使得Au纳米簇又具备了特异性的功能[5].由此可见，通过一步或多步功能化，能够使纳米材料弥补其本身在生物应用方面的缺陷.

近年来，安全、可降解的功能性生物分子正不断地被应用于生物纳米材料中.Zou Zhen等人利用明胶分子的物理性质并通过共价键作用，成功在介孔二氧化硅纳米颗粒表面上包裹了一层明胶层，大大提高了介孔二氧化硅的分散性，同时由于明胶能够在酸性条件下降解，使得功能化后的介孔二氧化硅纳米颗粒能够对pH值的变化有所响应，其药物释放行为在酸性条件下更为明显[6].Liu X S等人则研究了包裹了功能性生物分子聚多巴胺的Au纳米粒子的稳定性及生物毒性，发现经过功能化的Au纳米粒子具有极低的细胞毒性，并且能长期稳定存在于细胞内，没有表现出任何组织毒性[7].牛血清蛋白作为一种典型的功能性蛋白分子，具有便宜、安全、可降解、化学基团丰富等特点，它们不仅被用来改善材料的分散性，降低其细胞毒性，而且修饰到材料表面之后，为进一步修饰其他物质提供反应位点.Li C X等人利用蛋白分子高温变性的特点，在碳纳米管表面修饰上了一层蛋白分子壳，不仅大大提高了材料的分散性，还成功降低了碳纳米管的细胞毒性[8].Liu J B等人通过疏水和静电作用，在石墨烯表面修饰蛋白分子，并以这些蛋白分子提供的化学基团作为反应位点，在石墨烯上组装了各种金属纳米粒子[9].

文中通过实验设计，尝试利用蛋白分子高温变性的特点和静电作用，将其修饰在传统载药材料——介孔二氧化硅纳米颗粒表面，观察蛋白对材料药物释放行为的影响.结果发现：通过加热变性方式来修饰牛血清蛋白时，牛血清蛋白能在介孔二氧化硅纳米颗粒表面形成蛋白外壳，并抑制了在不同pH值环境下的药物释放行为.

1 实验部分

1.1 实验材料

所有化学用品都未进行预处理；所有溶液均由经Millipore Milli-Q系统获得的二次水配制；十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，分析纯，北京化工有限公司；正硅酸乙酯(TEOS)，分析纯，北京化工有限公司； 3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)，分析纯，阿拉丁试剂(上海)有限公司；牛血清蛋白(BSA)，阿拉丁试剂(上海)有限公司；盐酸阿霉素(Dox)，北京华奉联博科技有限公司；氨水、乙醇，分析纯，北京化工有限公司.实验中使用的磷酸缓冲液(PBS)由磷酸一氢钠和磷酸二氢钠配制.

1.2 实验仪器

透射电子显微镜(H-600)，日本株式会社日立制作所；紫外/可见分光光度计(LAMBDA 25)，珀金埃尔默仪器有限公司；动态光散射仪(ZEN 3600)，英国马尔文仪器有限公司.

1.3 材料合成

1.3.1 介孔二氧化硅纳米颗粒的制备及氨基功能化

称取0.25 g CTAB粉末加入120 mL水中，充分搅拌.待CTAB粉末完全溶解后，加入0.825 mL 2 mol/L的NaOH溶液，并加热至80 ℃.随后，逐滴滴加1.25 mL TEOS溶液，继续搅拌，回流处理2 h.待反应结束后，使用离心机8 000 r/min处理，去除上清液，并再次将所获沉淀用水重新分散.反复处理4次后，将所获沉淀再次分散于20 mL乙醇溶液和0.2 mL质量分数为37.2 %的浓盐酸中，79 ℃回流处理16 h.反应结束后，离心水洗4次.然后将所获沉淀放入真空干燥箱，60 ℃烘干过夜.获得介孔二氧化硅纳米颗粒.

为了获得氨基功能化的介孔二氧化硅纳米颗粒，在制备过程中，加入了APTES溶液.同样取0.25 g CTAB粉末分散于120 mL水中，加入0.825 mL 2 mol/L的NaOH溶液，并加热至80 ℃，随后逐滴滴加1.25 mL TEOS溶液.加热回流处理2 h后，将0.1 mL APTES分散于2 mL乙醇溶液中，并逐滴加入反应溶液中，继续加热4 h.反应结束后，离心水洗4次，并将沉淀再次分散于20 mL乙醇溶液和0.2 mL质量分数为37.2 %的浓盐酸中，79 ℃回流处理16 h.反应结束后，离心水洗4次，将沉淀放入60 ℃真空干燥箱中，烘干过夜.获得氨基功能化的介孔二氧化硅纳米颗粒.

1.3.2 介孔二氧化硅纳米颗粒负载阿霉素

称取8 mg介孔二氧化硅纳米颗粒分散于4 mL 0.125 g/L pH值为8.0的阿霉素PBS溶液中，避光搅拌过夜.负载结束后，通过离心处理，使用pH值为7.4的PBS溶液水洗数次，去除掉负载在介孔二氧化硅纳米颗粒表面的阿霉素分子.

1.3.3 牛血清蛋白功能化介孔二氧化硅纳米颗粒

首先，通过加热变性的方式修饰牛血清蛋白.取5 mg负载了药物的介孔二氧化硅纳米颗粒分散于5 mL 1 g/L牛血清蛋白溶液中，60 ℃加热15 min.反应结束后，离心水洗处理4次.获得牛血清蛋白功能化的介孔二氧化硅纳米颗粒.

随后，通过静电作用的方式修饰牛血清蛋白.取5 mg负载了药物的氨基功能化的介孔二氧化硅纳米颗粒分散于5 mL 1 g/L牛血清蛋白溶液中，搅拌60 min.反应结束后，离心水洗处理4次.获得牛血清蛋白功能化的介孔二氧化硅纳米颗粒.

1.3.4 测试牛血清蛋白对介孔二氧化硅纳米颗粒药物能力的影响

取2 mg功能化后的载药材料，分别分散在2 mL pH值为7.4和pH值为5.0的PBS溶液中.充分分散后，将溶液转移到摇床中，37 ℃恒温振动.定时取出样品进行离心处理0.5 h、2 h、12 h，收集上清液，并将材料再次分散在2mL相应的pH值的磷酸缓冲液中，放入摇床继续振动.同时，选用载药后未修饰的介孔二氧化硅作为控制组，以相同条件进行药物释放实验.

利用紫外/可见分光光度计测量不同浓度下阿霉素在波长482 nm处的吸光强度，绘制阿霉素吸光强度-浓度的标准曲线.测量上清液中阿霉素在482 nm处的吸光强度，从而计算出每次上清液中阿霉素的浓度，绘制出阿霉素释放率与时间的关系曲线.

2 结果与讨论

参考之前文献报道，选用CTAB作为软模板剂，成功制备了介孔二氧化硅纳米颗粒[10].通过TEM观察，介孔二氧化硅纳米颗粒的尺寸处于50～100 nm之间，有明显的孔道结构(图1).同时，为了对介孔二氧化硅氨基功能化，在制备的过程中，加入了带氨基的硅烷偶联剂ATPES.反应结束后，测量材料的Zeta电势，发现介孔二氧化硅纳米颗粒表面电势由(-28.3±0.7)mV变为(31.9±0.7)mV.文献[11]通过修饰ATPES，其介孔二氧化硅的表面电势能由(-39.4±0.9) mV变为(32.4±0.5) mV.虽然

电位变化并没有文献[11]那么大，但考虑到正负电荷已经发生变化，因此，认为APTES被成功修饰到了介孔二氧化硅纳米颗粒表面，使材料带正电.

图1 不同介孔二氧化硅TEM形貌

Fig.1 The TEM images of different mesoporous silicon

众所周知，化疗药物阿霉素在pH值越高的水溶液中溶解度越低，因此，常常被研究者选为负载药物应用于药物释放实验中[12].现将获得的介孔二氧化硅纳米颗粒分散在pH值为8 的阿霉素溶液中，搅拌过夜.通过静电作用，带正电的Dox分子能够吸附在带负电的介孔二氧化硅纳米颗粒的孔道之中[13].如图2所示，负载了阿霉素的介孔二氧化硅纳米颗粒在482 nm处有了阿霉素的特征吸收峰，由此可以判断阿霉素成功负载在了介孔二氧化硅纳米颗粒的孔道之中.另一方面，由于氨基功能化的介孔二氧化硅纳米颗粒的氨基基团只集中在材料表面，因此，利用同样的方法，在氨基功能化的介孔二氧化硅纳米颗粒的孔道中负载了化疗药物阿霉素(图 3).

为了研究功能性生物分子对纳米材料的修饰及影响，通过高温加热变性和静电作用两种方式促使牛血清蛋白作用在介孔二氧化硅纳米颗粒的表面上，并观察这种蛋白分子对药物释放行为的影响.

图2 加热修饰的紫外可见分光光谱

Fig.2 The UV-Vis absorption spectra of decorating by heating

图3 静电修饰的紫外可见分光光谱

Fig.3 The UV-Vis absorption spectra of decorating by electrostatic interaction

通过高温加热，牛血清蛋白能够以变性的方式团聚在纳米材料的表面上[14].观察TEM图发现：经过60 ℃处理的牛血清蛋白，能以外壳的形式包裹在介孔二氧化硅纳米颗粒的表面，介孔二氧化硅纳米颗粒的孔道结构消失，并且表面上出现了颗粒状的结构(见图1).观察紫外/可见分光光谱，发现处理后的介孔二氧化硅纳米的吸收光谱发生了变化，其趋势与牛血清蛋白的吸收光谱一致，这进一步证明了牛血清蛋白成功修饰在了介孔二氧化硅纳米颗粒的表面上(图2).而在利用静电作用修饰牛血清蛋白的实验中，选用了氨基功能化后的介孔二氧化硅纳米颗粒作为药物载体，并使之与牛血清蛋白相互作用.由于在pH为7.4的水溶液条件下，氨基功能化后的介孔二氧化硅纳米颗粒带正电，而牛血清蛋白带负电，尝试通过简单的搅拌使之相互作用，经过60 min的处理，发现牛血清蛋白也被成功修饰在了介孔二氧化硅纳米颗粒的表面上.观察TEM图发现：经过蛋白处理后氨基化介孔二氧化硅纳米颗粒的孔道结构同样消失，但是表面上并未出现颗粒状的结构(图1).同时，处理后的纳米颗粒的紫外分光吸收光谱在250 nm以下，吸光度明显增加(图3).这说明通过静电作用牛血清蛋白能够吸附在纳米粒子表面，但未发生变性团聚现象，因此，未能在材料表面发现颗粒状的结构.同时，由于蛋白分子的吸附，原材料的紫外分光吸收光谱也发生了改变.

为了检测这类新材料的药物释放行为，模拟了正常细胞及癌细胞的生理条件，分别将材料置于pH值为7.4与pH值为5.0的磷酸缓冲液中，观察其药物释放行为.定时取样，通过离心的方式，测取了释放液中阿霉素在482 nm处的吸光度，计算并绘制了释放率与时间的关系图(见图4、图5).由图4、图5可知：利用高温加热变性手段修饰的牛血清蛋白无论在哪种条件下，都阻止了阿霉素的释放，12 h后，释放率最终维持在40 %左右，而控制组的释放率接近80 %(图4、图5). 另一方面，通过静电作用修饰的牛血清蛋白，则只是减缓了药物释放的速率，并使材料药物释放行为对pH值的变化有了更强的响应.12 h后，当pH值偏中性时，载药材料的药物释放量为50 %；而当pH值偏酸性时，药物释放量提升了到80 %；对照控制组，药物释放率接近饱和(图5).不难发现，通过静电作用修饰的牛血清蛋白，不仅能够起到药物缓释的作用，还能提高药物释放行为对pH值变化的响应.对比加热组，通过静电作用修饰了蛋白的材料，在pH值偏酸性的环境下的药物释放率较pH值偏中性的环境下提升了34 %，更有利于癌细胞的治疗(图6).

负载了阿霉素的介孔二氧化硅(SiO2/Dox@BSA)在pH值为5.0和pH值为7.4的条件下的药物释放行为

图4 加热变性修饰的药物释放行为

Fig.4 The release profiles of Dox of SiO2/Dox@BSAdecorating by heating

通过静电修饰牛血清蛋白的负载了阿霉素的氨基功能化的介孔二氧化硅(SiO2-NH2/Dox@BSA)在pH值为5.0和pH值为7.4的条件下的药物释放行为

图5 静电修饰的药物释放行为

Fig.5 The release profiles of Dox of SiO2-NH2/Dox @BSA decorating by electrostatic interaction

图6 两种处理方法随pH值变化的药物释放量的变化

Fig.6 The charges of Dox releases of SiO2/Dox@BSA and SiO2-NH2/Dox@BSA at pH 5.0 and pH 7.4

对比两组实验，分析造成这种现象的原因主要是由修饰在材料表面的蛋白分子的状态决定的.通过高温处理，牛血清蛋白的分子能够发生构象的变化，最后以团聚的形式在材料表面上成壳，形成了一定的空间位阻，因此无差别地阻碍了药物分子的扩散.而通过静电作用修饰的蛋白分子，其构象并不会发生特别大的改变，不会以团聚的形式存在，所以，不会完全阻挡药物分子的扩散.同时由于蛋白分子上含有多种化学基团，在不同pH值条件下，这些化学基团能与药物分子产生强弱各异的作用力，因此，促进了材料药物释放行为对pH变化的响应.

3 结 论

通过高温加热变性和静电作用两种方式，成功地将生物功能分子牛血清蛋白修饰在了介孔二氧化硅纳米粒子的表面.观察材料形貌，发现不同的修饰方法会对修饰的蛋白分子产生不同的影响.而这种变化，最终决定了材料本身的药物释放行为.变性团聚的蛋白壳无差别地阻碍了药物的释放，而以分子形式存在的蛋白分子，则促进了材料药物释放行为对环境pH值的响应，有利于载药治疗癌细胞的应用.不难看出，牛血清蛋白作为功能性分子在载药材料功能化方面有着极大的研究潜力.同时，功能性生物分子虽然有着优异的性能，但由于其结构过于复杂，在功能化应用的过程中，往往会因为自身结构的变化而失去功效.如何选用合适的功能化手段，对将来功能性生物分子的研究具有重要意义.

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Modification of Nanomaterials with Functional Bio-molecules

LIU Yu-wei， GUO Zhuo

(Shenyang University of Chemical Technology， Shenyang 110142， China)

The functional bio-molecules have drawn widespread interest because of their good biocompatibility and abundant chemical group.How to decorate the functional bio-molecules on the nanomaterials to overcome shortage of the materials on the biomedicine would be a meaningful reaches.In our report，the Bovine Serum Albumin(BSA) has been used as the functional bio-molecule and was decorated on the surface of the mesoporous silicon(mSiO2) through different methods.The release behavior has been also studied.The results showed that when the BSA was decorated on the mSiO2by denaturing the protein，the releases of the medicine have been suppressed at different pH values.When the BSA was decorated on the amino functional mSiO2(mSiO2-NH2) through the electrostatic interaction，the protein molecules could adsorb on the surface of mSiO2-NH2，and improved the sensibility of the release behavior at different pH values.

functional bio-molecules； bovine serum albumin； mesoporous silicon； medicine release

2014-10-09

辽宁省教育厅资助项目(LJQ201203)

刘宇炜(1989-)，男，湖南溆浦人，硕士研究生在读，主要从事生物材料的研究.

郭卓(1975-)，女，辽宁沈阳人，副教授，博士，主要从事药物缓释材料的研究.

2095-2198(2016)04-0333-06

10.3969/j.issn.2095-2198.2016.04.010

TB34

A