甲苯咪唑在鲫体内的药动学及残留消除研究

潘浩，王荻，卢彤岩

（1.中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，黑龙江 哈尔滨 150070；2.上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306）

甲苯咪唑在鲫体内的药动学及残留消除研究

潘浩1,2，王荻1，卢彤岩1

（1.中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，黑龙江 哈尔滨 150070；2.上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306）

在水温（20±0.5）℃下，给体质量（50±10）g的鲫Carassius auratus单剂量口灌20mg/kg（体质量）甲苯咪唑后0.25h、0.5h、0.75h、1h、1.5h、2h、4h、6h、8h、12h、24h、36h、48h，及72h，采集鲫血浆，利用高效液相色谱法测定血浆中药物的浓度，药动学DAS3.0软件进行数据分析和处理，研究甲苯咪唑在鱼体内的吸收和消除规律。结果表明：单次口灌给药后，甲苯咪唑在血浆中的药时关系符合一级吸收二室开放模型。每天给药一次，连续3d，氨基甲苯咪唑（MBZ-NH2）于25d后低于检测限（0.0465μg/mL）。在本试验条件下，建议休药期不低于25d。

甲苯咪唑；鲫；高效液相色谱法；药动学；残留

甲苯咪唑（Mebendazole）又称为甲苯哒唑、安乐士，属于苯并咪唑类药物，化学名为氨基甲酸甲酯（5-苯丙酞基-1H-苯并咪唑-2-基），是一种广谱、高效、低毒的人畜共用抗蠕虫药[1]，对动物及鱼体消化道寄生虫病有良好的治愈效果[2-4]。近几年随着水产动物寄生虫病的大量频繁发作，甲苯咪唑越来越广泛地应用于水产养殖中寄生虫病的治疗[5]。但有研究表明，大部分苯并咪唑类药物具有导致畸形和致使基因发生突变的作用[6]。因此，从2000年开始，欧盟针对动物性食品中甲苯咪唑的残留出台相应的限量标准，规定：绵羊、山羊和马属动物的脂肪、肌肉中的苯并咪唑及代谢物的最大残留限量（MRL）为60μg/kg和60μg/kg，肾脏和肝脏中的苯并咪唑及代谢物的最大残留限量（MRL）为60μg/kg和400μg/kg[7]。国际食品法典委员会（CAC）也做出了规定：畜产品肌肉中甲苯咪唑能检测出的MRL为60μg/kg[8]。针对药物残留过高的现象，我国对动物源性食品中甲苯咪唑残留也做出相应规定，限量规定：甲苯咪唑在羊、马的肝脏、肾脏中的最大残留限量（MRL）为400μg/kg和60μg/kg，在肌肉和脂肪的最大残留限量（MRL）为60μg/kg和60μg/kg[9]，与欧盟标准一致。药物的药物代谢动力学研究是制定临床中合理给药方案的根据，更是如何最大限度地发挥药物的最佳疗效、最大限度地减少副作用的理论基础，而研究药物的残留消除规律则有助于制定休药期。本试验通过研究甲苯咪唑在鲫Carassius auratus体内的药物代谢动学及其主要的代谢产物，为制定其最大残留限量（MRL）提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验鱼

体质量为（50±10）g的鲫由黑龙江水产研究所呼兰养殖基地提供，暂养驯化3d。试验在室内自动循环水族箱中进行。试验期间不投喂，水温保持在（20±0.5）℃，正常供氧，溶氧保持在6.00mg/L以上。给药前停喂24h。

1.1.2 试验用品

药品：甲苯咪唑原粉（含量99%）；甲苯咪唑（MBZ）标准品含量99.7%，批号46404；羟基甲苯咪唑（MBZ-OH）标准品含量99.5%，批号35404；氨基甲苯咪唑（MBZ-NH2）标准品含量99.6%，批号35403，均购自北京翔运同创科技有限公司；乙酸乙酯、正己烷、乙腈、甲酸、甲醇均为色谱纯。

标准贮备液：准确称取甲苯咪唑、羟基甲苯咪唑、氨基甲苯咪唑标准品各10mg，用98%甲酸溶解于100mL棕色量瓶中，加入色谱级甲醇至刻度后充分混匀，配制成浓度为100μg/mL的甲苯咪唑混合标准贮备溶液。将配置好的贮备液置于冰箱中避光冷藏备用。

流动相：（0.3%，pH4）磷酸∶乙腈=60∶40（V/V）比例配制，混匀后过0.45μm有机滤膜过滤，现配现用。

1.1.3 试验仪器

戴安U-3000高效液相色谱仪（美国Thermo Fisher公司）；3K15高速离心机（Sigma公司）；HYQ-3110调速混匀器（深圳市宝域科技有限公司）；SB5002电子天平（上表电子仪器厂）；DCY-24A氮吹仪（上海精密仪器仪表有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 给药剂量及样品采集

（1）药动学试验。按20mg/kg体质量的给药剂量对鲫单次口灌MBZ，给药后0.25h、0.5h、0.75h、1h、1.5h、2h、4h、6h、8h、12h、24h、36h、48h，及72h，在尾鳍与侧线间入针取血2mL，每次取6尾鱼，采样前用75%酒精棉球于进针部位进行消毒（注射器用3‰肝素钠润洗后晾干）。血液样品置于4℃冰箱过夜后4 000 r/min离心5min，吸取上层血浆，保存在-20℃冰箱中。

（2）残留试验。以有效成分20mg/kg（体质量）的剂量，每天一次，连续3d对鲫口灌MBZ。在停药后第1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d、9d、11d、13d、17d、25d，及30d随机取鱼6尾，于鱼的背部剥离皮肤后用手术刀采集肌肉组织，保存于-20℃冰箱中备用。

1.2.2 样品的前处理

（1）血浆：将血浆从-20℃取出置于冰上自然解冻，取1mL血浆样品置于加入3mL乙酸乙酯的50mL离心管中，振荡4min，10 000r/min离心5min，取上清液。按照上述方法将血浆反复充分提取2次，合并上清液于20mL离心管中。在通风柜内40℃氮吹吹干后加入2mL流动相溶液，高速振荡6min至残留物完全溶解。加入2mL正己烷，再漩涡高速振荡4min，充分混匀后吸取所有液体转移到10mL离心管中，10 000r/min离心10min，吸取试管底层液体于新离心管中，加入2mL正己烷，按上述处理重复提取一次后，将两次提取液混合。提取液经0.45μm微孔滤膜过滤后，储存于进样瓶中低温保存待测。

（2）肌肉：准确称取1g肌肉于50mL离心管中，吸取3mL乙酸乙酯加入离心管后匀浆40s，振荡4min，充分混匀后，15 000r/min离心10min，吸取上清液加入到20mL离心管中。按上述提取步骤重复提取2次，合并3次提取上清液，混匀后放入通风柜内40℃氮吹吹干，向管底残留物加入2mL流动相溶液，高速振荡10min直至残留物完全溶解。吸取2mL正己烷加入其中，继续高速振荡6min。将离心管内所有液体转移至10mL离心管中，15 000r/min离心10min，吸取底层液体加入新离心管中，加入2mL正己烷，按上述方法重复上述提取。下层液体过0.45μm微孔滤膜过滤后，储存于进样瓶中低温保存待测。

1.2.3 高效液相色谱条件

色 谱 柱 ：Agilent HC-C18柱 （250mm× 4.6mm，5μm）；柱温：35℃；流动相：乙腈∶0.3%磷酸溶液（pH4）=40∶60（v∶v）；流速：1mL/min；进样量：20μL；紫外检测波长：289 nm。

1.2.4 标准曲线的绘制

准确移取甲苯咪唑混合标准储备液，依次稀释成0.02μg/mL、0.04μg/mL、0.08μg/mL、0.1μg/mL、0.2μg/ mL、0.4μg/mL、0.8μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL、40μg/mL，及100 μg/mL的标准工作液，过0.45μm有机相滤头后用高效液相色谱仪进行测定，检测药物含量。以峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标，绘制标准曲线，计算其回归方程和相关系数。

1.2.5 回收率测定

取1g鲫空白肌肉与0.5mL空白血浆，分别添加0.08μg/mL、0.2μg/mL、4μg/mL，及10μg/mL的MBZ混合标准液，各组添加标准液的总体积为1mL，肌肉组织与血浆的每个标准液添加浓度设置3个平行组，加入标准液后在4℃静置过夜，按照样品前处理的方法进行处理后，用高效液相色谱仪测定。按照下列公式进行计算：回收率（%）=实测药物浓度/实际药物浓度×100%。

1.2.6 精密度测定

一天内不同时间重复测定3次，在一周内的不同时间再重复测定3次，计算出不同浓度梯度下肌肉组织和血浆样品的相对标准偏差，计算出各组织的日内精密度和日间精密度。

1.3 数据处理

根据高效液相色谱检测报告得出标准曲线，利用DAS3.0软件拟合药-时曲线与药动学模型，计算各参数。

2 结果与分析

2.1 标准品色谱图

在本试验条件下，氨基甲苯咪唑、羟基甲苯咪唑和甲苯咪唑的出峰时间分别在3.433 min、4.053 min和8.273min（图1）。

图1 甲苯咪唑标准品色谱图Fig.1 Chromatography of standard mebendazole（MBZ）

2.2 标准曲线与最低检测限

以上述建立的高效液相色谱检测方法所测得结果，根据S/N=3计算，得到氨基甲苯咪唑、羟基甲苯咪唑、甲苯咪唑的最低检测限分别为0.0465μg/ mL、0.0374μg/mL和0.045μg/mL。所得标准曲线方程为

MBZ：y=25.93x+21.16，r=0.9991；

MBZ-OH：y=2.1683x+7.8316，r=0.9998；

MBZ-NH2：y=1.0972x-0.0172，r=0.9998。

三种物质的高中低回收率都在90%以上，可满足提取要求。

2.3 回收率与精密度

本试验条件下，血浆中四个浓度添加水平的MBZ-OH、MBZ-NH2和 MBZ的回收率分别为89.5%～95.6%、78.9%～94.5%和90.5%～96.8%；肌肉中四个浓度添加水平的MBZ-OH、MBZ-NH2和MBZ的回收率分别为89.9%～91.7%、88.9%～98.7%和90.4%～96.2%（表1）。

MBZ-OH的日内精密度和日间精密度分别为（0.24±0.10）%和（0.25±0.12）%，MBZ-NH2的日内精密度和日间精密度分别为（0.12±0.06）%和（0.15±0.07）%，MBZ的日内精密度为和日间精密度分别为（0.14±0.13）%和（0.17±0.08）%。

表1 MBZ-OH、MBZ-NH2和MBZ在血浆和肌肉中的平均回收率（n=3）Tab.1 Average recovery rate of MBZ-OH,MBZ-NH2and MBZ in plasma and muscle（n=3）

2.4 甲苯咪唑在鲫体内的药时曲线主要药动学参数

在本试验条件下，在鲫两种组织中均只检测出MBZ-NH2，在鲫血浆中药动学特征符合一级吸收二室开放模型，其代谢方程为：

C=14.975 e-0.113t+0.064e-0.005t-15.039e-0.08t。

甲苯咪唑在鲫体内的主要药物代谢动力学参数如表2所示。图2为在温度（20±0.5）℃时以20mg/kg（体质量）给药量给鲫单次口灌甲苯咪唑后，药物在鲫血浆中的浓度随时间变化的规律。

2.5 残留消除规律

给药后各采样时间点，MBZ-NH2在肌肉组织中的含量见表3，消除曲线见图3。

由图3看出，停药约3d肌肉中药物浓度达峰值，浓度为0.4130μg/mL，第25d降到最低检测限以下，表明MBZ-NH2进入鱼体内后吸收迅速，但是消除缓慢，给药后第25d开始低于最低检测限。

表2 MBZ-NH2在鲫血浆中的药代动力学参数Tab.2 Pharmacokinetic parameters of MBZ-NH2in plasma of crucian carp

图2 MBZ-NH2在鲫血浆中的浓度与时间关系曲线Fig.2 Relationship between concentration and time of MBZ-NH2in plasma of crucian carp

表3 MBZ-NH2在鲫肌肉组织中的浓度Tab.3 Concentrations of MBZ-NH2in muscle of crucian carp

图3 MBZ-NH2在鲫肌肉中的消除曲线Fig.3 Elimination curve of MBZ-NH2in muscle of crucian carp

3 讨论

3.1 MBZ-NH2在鲫体内的药动学特征

有关研究表明，当V/F（c）（表观分布容积值）大于1.0L/kg时，表明药物广泛分布于机体内。由本试验结果可知，MBZ-NH2的V/F（c）为97.079L/kg，表明MBZ-NH2在鲫体内广泛大量分布。比较MBZNH2的分布相半衰期T1/2α和消除相半衰期T1/2β可以发现，MBZ-NH2吸收快，消除极其缓慢。MBZ-NH2在鲫体内的含量随时间推移逐渐升高，并分别在24h达到峰浓度：0.73μg/mL，这与胥宁[10]等的结果略有差异。相同给药剂量下，MBZ-NH2在鱼体内达峰时间不同也说明了不同鱼类对药物的代谢动力学特征不同。这种现象在对史氏鲟 Acipenser schrencki Brandt[11]、镜鲤Cyprinus carpio Songpu[12]、鲫Carassius auratus[13]、草鱼Ctenopharyngodon idellus[14]、虹鳟Oncorhynchus mykiss[15]、斑点叉尾鮰I－etalurus Punetaus[16]、大菱鲆Psetta maxima[17]等鱼的研究中也得到大量的药代动力学试验的验证。

3.2 MBZ-NH2在鲫体内的药残

入口食品中药残的检测通常只选用食用组织，中国农业行业标准NY5070-2002《无公害食品水产品中渔药残留限量》关于鱼类药残选取的是肌肉和皮[13]。因此，本研究中只选取肌肉研究MBZ-NH2在鲫体内的残留消除规律。

在（20±0.5）℃水温条件下，以实际含量为20mg/ kg体质量的药物剂量，每天一次，连续3d对鲫口灌MBZ，在停药的第3d MBZ-NH2出现了明显的下降趋势。停药后，MBZ-NH2在肌肉中消除缓慢，尤其是第5d开始消除极其缓慢。因此制定MBZ的休药期主要应考虑MBZ-NH2的消除速度，同时还需要根据实际养殖水温和鱼自身情况来确定。鉴于本试验条件下的研究结果，建议在（20±0.5）℃水温条件时，鲫按20mg/kg剂量口服给药，以肌肉中药物残留为参考休药期，至少为25d（鉴于温度对鱼体内药物代谢的影响[17,18]，温度高于20℃，建议休药期仍为25d；若温度低于20℃，则建议适当延长休药期），或在与其他药物一同使用杀菌治疗鱼病时，可以参考其他药物的代谢期制定休药期。

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Pharmacokinetics and Residue Elimination of Mebendazole in Crucian Carp Carassius auratus

PAN Hao1,2,WANG Di1,LU Tong-yan1
（1.Heilongjiang River Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences,Harbin 150070,China; 2.College of Fisheries and Life Science,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China）

The pharmacokinetics and residue elimination of mebendazole（MBZ）were studied in crucian carp Carassius auratus with body weight of（50±10）g exposed to oral administration of MBZ at dose of 20 mg/kg bodyweight by a means of high performance liquid chromatography（HPLC）at water temperature of（20±0.5）℃.The drug concentrations in plasma were monitored in the crucian carp 0.25 h,0.5 h,0.75 h,1 h,1.5 h,2 h,4 h,6 h,8 h,12 h,24 h,36 h,48 h,and 72 h after drug administration,and analyzed by DAS 3.0 software.The results showed that the concentrations versus time of mebendazole in muscle were well described by two-department open model with first-order absorption after a single oral administration.The residues in the crucian carp by oral administration once a day for 3 d were found to be less than the maximum residue limit（MRL）（0.0465 μg/mL）at the 25 d for MBZ.The findings indicate that the withdrawal time should be no less than 25 d after administration under these conditions．

mebendazole;Carassius auratus;HPLC;pharmacokinetics;residue

S948

A

1005-3832（2016）04-0038-05

2016-03-09

公益性行业（农业）科研专项（201203085）；渔药使用风险评估及其控制技术研究与示范；现代农业产业技术体系建设专项资金项目（CARS-46）.

潘浩（1991-），男，硕士研究生，从事渔药药理及残留检测技术研究.E-mail:zcph6666@126.com

卢彤岩.E-mail:lutongyan@hotmail.com