α-酮戊二酸对松浦镜鲤肠道形态与功能的影响

李晋南，魏玉强，徐奇友，张冬梅

（1.中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，黑龙江 哈尔滨 150070；2.上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306）

α-酮戊二酸对松浦镜鲤肠道形态与功能的影响

李晋南1，魏玉强2，徐奇友1，张冬梅1

（1.中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，黑龙江 哈尔滨 150070；2.上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306）

本试验旨在研究不同蛋白源饲料中添加α-酮戊二酸（AKG）对松浦镜鲤肠道形态与功能的影响。在水温23℃下，将初始体质量为（217.93±0.78）g的松浦镜鲤Cyprinus carpio Songpu 400尾，随机分成4组，每组5个重复，每个重复20尾鱼，饲养在控温循环水系统中，投喂4种在不同蛋白源的等氮等脂饲料中添加不同剂量的α-酮戊二酸（AKG）的饲料10周，即饲料1（44%豆粕+0%AKG）、饲料2（44%豆粕+1.5%AKG）、饲料3（30%豆粕+10%鱼粉+0%AKG）、饲料4（30%豆粕+10%鱼粉+1.5%AKG），饲料中蛋白质和脂肪水平分别为28%和5.1%。结果表明：不同蛋白源饲料中添加AKG能显著提高松浦镜鲤后肠皱襞高度、前肠肌层厚度和前肠Na+,K+-ATP酶活性（P＜0.05）；蛋白源和AKG对肠道形态指标和Na+,K+-ATP酶活性无显著交互作用（P＞0.05）；饲料中蛋白源添加AKG能显著提高松浦镜鲤前肠和中肠蛋白酶、脂肪酶活性（P＜0.05），蛋白源和AKG对后肠蛋白酶活性具有显著交互作用（P＜0.05）。综上所述，饲料中添加1.5%AKG可以促进松浦镜鲤肠道发育，增强肠道消化酶活性。

α-酮戊二酸；松浦镜鲤；肠道形态；消化酶；Na+,K+-ATP酶

α-酮戊二酸（α-ketoglutarate，AKG）是生物体三羧酸循环中重要的中间产物，是谷氨酰胺的前体物，在溶液中具有良好的稳定性，能够克服谷氨酰胺的缺点[1]。在三羧酸循环过程中，AKG能够运载和贮存氮，参与多种氨基酸转氨基作用，为精氨酸、鸟氨酸、谷氨酰胺和谷氨酸的合成提供碳骨架。外源性AKG可以替代部分谷氨酸和谷氨酰胺，为肠黏膜细胞和肠道菌群的代谢提供能量，提高机体消化功能，诱导肠黏膜细胞的增殖，促进营养物质的吸收[2]，减少细菌移位，维持肠道屏障功能。近年来，关于AKG对促生长、肠道发育、消化吸收及抗氧化能力等方面的影响，已经在大鼠[2]、肉仔鸡[3]以及仔猪[4,5]中进行了相关研究。通过对水产动物的研究表明，AKG可以提高松浦镜鲤增重率和蛋白质效率[6]。但AKG对水产动物的其他作用，还需要进一步的研究。

豆粕蛋白质含量高、来源广，是替代饲料鱼粉的最佳植物蛋白源。但有研究表明，豆粕能引起大马哈鱼 Oncorhynchus tshawytscha和虹鳟 Oncorhynchus mykiss肠道病理变化[7,8]，而对比目鱼Hippoglossus hippoglossus和鲳Pampus sinensis的肠道发育却没有不良影响[9,10]。本试验在不同蛋白源饲料中添加AKG投喂松浦镜鲤，研究不同蛋白源饲料中添加AKG对松浦镜鲤肠道形态与功能的影响，为AKG在水产动物中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

AKG购自Sigma-Aldrich公司，白色粉末，纯度≥98.5%。

本试验按2×2因子设计配制成4种等氮等脂的试验饲料，即饲料1（44%豆粕+0%AKG）、饲料2（44%豆粕+1.5%AKG）、饲料3（30%豆粕+10%鱼粉+0%AKG）、饲料4（30%豆粕+10%鱼粉+1.5% AKG）。饲料蛋白质和脂肪水平分别为28%和5.1%，其饲料配方和营养成分见参考文献[11]。各饲料原料粉碎后，过80目筛，逐级混合均匀，用小型颗粒机挤压成颗粒饲料，常温风干后，于-20℃冰柜中保存待用。

试验鱼选自黑龙江水产研究所呼兰试验站。

1.2 方法

试验选择健康、规格一致的初始体质量为（217.93±0.78）g的松浦镜鲤400尾，预饲2周后，随机分成4组，每组5个重复，每个重复20尾，在可控温循环水系统中养殖10周，分别投喂不同试验饲料。试验期间，水温23℃，溶氧大于5mg/L，氨氮小于0.1mg/L。每天8:00、13:00、18:00，饱食投喂3次，记录投喂量和鱼摄食情况，定期检测水质，确保水质良好。

1.3 肠道形态结构观察

肠道组织切片的制备：试验结束时，将鱼禁食24h，每缸随机选取4尾鱼，用麻醉剂（MS222）麻醉，置于冰盘上解剖，取肠道，去除肠表面脂肪，用冰浴的0.86%生理盐水冲洗后去除内容物，滤纸吸干水分，将肠道分为前肠、中肠和后肠（第一个回折拐弯点前为前肠，第二个回折拐弯处至最后一个拐弯处为中肠，最后一个回折拐弯点至肛门之间为后肠），固定于Bouin氏液中。将Bouin氏液中固定的肠道，经过乙醇逐级脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、切片、HE染色、脱水、透明，最后用中性树胶封片，每段肠样品用Motic显微图像系统（Motic Images Plus 2.0软件）测量8个以上完整皱襞高度和肌层厚度（单位μm，成像倍数为10×100）。

1.4 肠道消化酶活性的测定

试验结束时，按上述方法测量鱼体长、体质量，剥离肠道，测量肠长度，计算肠长指数（肠长/体长）、肠体指数（肠质量/体质量）。前肠、中肠和后肠分别以生理盐水按1∶9质量体积比，用FJ-200CL高速组织匀浆机冰浴匀浆，匀浆液4℃4 000r/min离心10min，上清液为粗酶液，分装后保存于-20℃冰箱，用于测定蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性[12]。

1.5 肠道Na+,K+-ATP酶活性的测定

采用南京建成试剂盒测定Na+,K+-ATP酶活性，其活力单位定义为每h每g组织分解ATP产生1mol无机磷为1个ATP酶活单位。

1.6 统计分析

数据采用平均值±标准差表示，用SPSS 17.0软件分析，采用双因素方差分析和Duncan′s多重比较进行统计，显著性水平为P＜0.05。

2 结果与分析

2.1 不同蛋白源和AKG剂量对松浦镜鲤肠道形态结构的影响

松浦镜鲤摄食添加1.5%AKG的饲料时，后肠皱襞高显著高于不添加AKG的对照鱼（P＜0.05），而在复合蛋白源中添加1.5%AKG显著提高了中肠皱襞高度和前肠肌层厚度（P＜0.05）。与豆粕蛋白源饲料比较，复合蛋白源饲料显著降低了中肠皱襞高度（P＜0.05）。蛋白源和AKG对前肠肌层厚度具有显著的交互作用（P＜0.05）（表1）。

蛋白源和AKG剂量对松浦镜鲤肠长指数和肠体指数均无显著影响（P＞0.05）（表2）。双因素方差分析表明，蛋白源和AKG剂量对肠长指数和肠体指数均没有交互作用（P＞0.05）。

表1 饲料蛋白源和AKG剂量对松浦镜鲤肠道形态结构的影响（n=5）Tab.1 Effects of different dietary protein sources and doses of α-ketoglutarate（AKG）on intestinal morphology of Songpu mirror carp

表2 饲料蛋白源和AKG剂量对松浦镜鲤肠道肠体指数和肠长指数的影响（n=10）Tab.2 Effects of different dietary protein sources and doses of α-ketoglutarate（AKG）on Intestine body length index and body weight index of Songpu mirror carp

表3 饲料蛋白源和AKG剂量对松浦镜鲤肠道消化酶活性的影响（n=4）Tab.3 Effects of different dietary protein sources and doses of α-ketoglutarate（AKG）on activities of intestinal digestive enzymes in Songpu mirror carp（U/g prot）

2.2 不同蛋白源和AKG剂量对松浦镜鲤肠道消化酶活性的影响

由表3可知，在复合蛋白源饲料中添加1.5% AKG显著提高了松浦镜鲤前肠和中肠蛋白酶以及脂肪酶活性（P＜0.05）；在豆粕蛋白源饲料中添加AKG显著提高前肠和中肠蛋白酶、前肠淀粉酶和脂肪酶活性（P＜0.05）。双因素方差分析可知，饲料中添加AKG显著提高了前肠和中肠蛋白酶、脂肪酶活性（P＜0.05）。蛋白源和AKG对后肠蛋白酶具有显著交互作用（P＜0.05）。

2.3 不同蛋白源和AKG剂量对松浦镜鲤肠道Na+,K+-ATP酶活性的影响

由表4可知，在复合蛋白和豆粕蛋白源饲料中添加AKG分别显著提高了松浦镜鲤前肠和后肠Na+,K+-ATP酶的活性（P＜0.05）。蛋白源和AKG对肠道Na+,K+-ATP酶活性不存在交互作用（P＞0.05）。

表4 饲料蛋白源和AKG剂量对松浦镜鲤肠道Na+,K+-ATP酶的影响（n=8）Tab.4 Effects of different dietary protein sources and doses of α-ketoglutarate（AKG）on intestinal Na+, K+-ATPase activities in Songpu mirror carp

3 讨论

鱼类肠道是营养物质消化和吸收的重要场所，无胃鱼类松浦镜鲤肠道的结构功能与其生长发育更为密切相关。鱼类肠道形成许多皱襞，其高度增加，微绒毛长度及粘膜厚度的增加，可以扩大肠道的表面积，增加肠道对营养物质的吸收能力，是水生动物肠道发育和吸收能力的重要标志[13]。有研究表明，饲料中添加豆粕对大西洋大比目鱼Hippoglossus hippoglossus[14]、斑点叉尾鮰Ictalurus punctatus[15]、埃及鳎Solea aegyptiaca[16]等的肠道形态没有显著影响。本试验中除中肠皱襞高度外，豆粕蛋白源饲料组与复合蛋白源饲料组相比，肠道形态没有明显差异。而复合蛋白源饲料组显著降低了中肠皱襞高度，其原因有待进一步研究。饲料中添加1% AKG可以显著提高仔猪肠道绒毛高度与隐窝深度的比值，提高绒毛表面积[13,17-19]。本试验中，饲料中添加AKG能显著提高松浦镜鲤肠道皱襞高度和肌层厚度。由此可知，AKG可以改善松浦镜鲤肠道结构，增加肠道对营养物质的吸收和消化能力。这可能是因为AKG为肠上皮细胞代谢提供能量[18]，促进肠道细胞的生长发育，促进肠道皱襞高度和肌层厚度的增加。

Na+,K+-ATP酶作为一种重要的膜转运蛋白，能分解体内ATP，为机体的各项生理活动提供能量，其活力是肠黏膜生长发育的重要标志之一[20]。肠道Na+,K+-ATP酶活性的升高表明肠道消化吸收能力增强。本试验中，饲料中添加AKG显著提高了松浦镜鲤肠道Na+,K+-ATP酶活性，改善了肠道对营养物质的吸收能力。有研究[21]表明，豆粕替代鱼粉对建鲤的Na+,K+-ATP酶活性没有显著影响，这与本试验结果一致。

肠道消化酶可以作为衡量鱼类对营养物质消化、吸收的重要指标[22]。动物机体生长发育的快慢与消化酶活性的高低存在一定的正相关性[23]。有研究表明，豆粕替代鱼粉对翘嘴红鲌Erythroculter Ilishaeformis Bleeker肠道淀粉酶和脂肪酶活性没有显著影响[24]，这与本试验结果相一致。本试验结果显示，不同蛋白源饲料中添加AKG显著提高了松浦镜鲤前肠和中肠蛋白酶、脂肪酶活性和前肠淀粉酶活性，这与AKG可以显著提高松浦镜鲤前肠淀粉酶和脂肪酶的活性[12]的结果较为一致。这些结果说明，饲料中添加AKG可以提高松浦镜鲤肠道消化酶活性，能促进肠道对营养物质的消化吸收，提高鱼体的生长速度。其原因可能是：AKG能够促进肠道和消化腺的生长发育，增加肠道消化酶的分泌量，提高肠道消化酶含量。饲料中添加AKG提高了松浦镜鲤的摄食量，即提高了肠道酶消化的底物浓度，刺激了肠道消化酶活性的增加[6,12,25]。

［1］Pierzynowski S G and Sjodin A.Perspectives of glutamine and its derivatives as feed additives for farm animals［J］. Journal ofAnimal and Feed Sciences,1998,7:79-91．

［2］Filip R,Wdowiak L,Harrison A P.et al.Dietary supplementation with phytohemagglutinin in combination with alpha-ketoglutarate limits the excretion of nitrogen via urinarytract［J］.Ann Agric Environ Med,2008,15（2）:309-315.

［3］余亲平,陈雁群,谢金蝉,等.日粮添加α-酮戊二酸对肉仔鸡生长性能及组织器官发育的影响［J］.中国畜牧兽医,2010,37（10）:10-14.

［4］Kristensen N B,Jungvid H,Fernández J A,et al.Absorption and metabolism of alpha-ketoglutarate in growing pigs［J］.J AnimPhysiol AnimNutr,2002,86（7-8）:239-245.

［5］Buddington R K,Pajor A,Buddington K K,et al.Absorption of alpha-ketoglutarate by the gastrointestinal tract of pigs［J］.Comparative Biochemistry and Physiology,Part A: Molecular and Integrative Physiology,2004,138:215-220.

［6］位莹莹,徐奇友,李晋南,等.不同蛋白质水平饲料中添加α-酮戊二酸对松浦镜鲤生长性能、体成分和血清生化指标的影响［J］.动物营养学报,2013,25（12）:2958-2965.

［7］Bureau DP,Harris AMand YoungCC.The effects ofpuri-fied alcohol extracts from soy products on feed intake and growth ofchinook salmon（Oncorhynchus tshawytscha）and rainbow trout（Oncorhynchus mykiss）［J］.Aquaculture，1998,161（1-4）:27-43.

［8］Burrells C,Williams P D,Southgate P J,et al.Immunological,physiological and pathological responses of rainbow trout（Oncorhynchus mykiss）to increasing dietary concentrations of soybean proteins［J］.Veterinary Immunology Immunopathology,1999,72（3-4）:277-288.

［9］Grisdale-Helland B,Ruyter B,Rosenlund G,et al.Influence of high contents of dietary soybean oil on growth,feed utilization,tissue fatty acid composition,heart histology and standard oxygen consumption of Atlantic salmon（Salmo salar）raisedattwotemperatures［J］.Aquaculture,2002,207（3-4）:311-329.

［10］Ostaszewska T,Dabrowski K,Palacios ME,et al.Growth and morphological changes in the digestive tract of rainbow trout（Oncorhynchus mykiss）and pacu（Piaractus mesopotamicus）due to casein replacement with soybean proteins［J］.Aquaculture,2005,245（1-4）:273-286.

［11］魏玉强,徐奇友,位莹莹,等.不同蛋白源饲料中添加α-酮戊二酸对松浦镜鲤肌肉成分、血清氨基酸和生化指标的影响［J］.东北农业大学学报,2015（1）:94-100.

［12］李晋南,徐奇友,王常安,等.谷氨酰胺及其前体物对松浦镜鲤肠道消化酶活性及肠道形态的影响［J］.动物营养学报,2014,26（5）:1347-1352.

［13］王蕾,刘坚,侯永清,等.α-酮戊二酸对LPS慢性应激仔猪小肠黏膜形态与功能的影响［J］.畜牧兽医学报, 2010,41（1）:46-52.

［14］Grisdale-Helland B,Helland S J,Baeverfjord G,et al. Full-fat soybean meal in diets for Atlantic halibut:growth, metabolism and intestinal histology［J］.Aqu Nutr,2002, 8（4）:265-270.

［15］Evans J J,Pasnik D J,Peres H,et al.No apparent differences in intestinal histology of channel catfish（Ictalurus punctatus）fed heat-treated and non-heat-treated raw soybeanmeal［J］.AquacultureNutrition,2005,11（2）:123-129.

［16］Bonaldo A,Roem A J,Pecchini A,et al.Influence of dietary soybean meal levels on growth,feed utilization and gut histology of Egyptian sole（Solea aegyptiaca）juveniles［J］.Aquaculture,2006,261（2）:580-586.

［17］王金泉,项方献,姚刚.中草药结合AKG对断奶仔猪生长及消化吸收功能的影响［J］.西北农林科技大学学报:自然科学版,2011,39（5）:27-31.

［18］胡泉舟,侯永清,丁斌鹰,等.α-酮戊二酸对仔猪小肠组织学形态与功能的影响［J］.动物营养学报,2008,20（6）:662-667.

［19］胡泉舟.α-酮戊二酸对断奶仔猪生长性能和肠道功能的影响［D］.武汉:武汉工业学院硕士学位论文,2008.

［20］Veillette P Aand YoungG.Temporal changes in intestinal Na+,K+-ATPase activity and in vitro responsiveness to cortisol in juvenile chinook salmon［J］.Comparative Biochemistry and Physiology Part A:Molecular＆Integrative Physiology,2004,138（3）:297-303.

［21］姜俊,周小秋,银龙,等.膨化饲料中豆粕替代鱼粉对建鲤生长性能、体成分和消化吸收功能的影响［J］.华北农学报,2015（S1）:107-111.

［22］Tang L,Wang G X,Jiang J,et al.Effect of methionine on intestinal enzymes activities,microflora and humoral immune of juvenile Jian carp（Cyprinus carpio var.Jian）［J］.Aquaculture Nutrition,2009,15（5）:477-483.

［23］叶元土,张勇,张字,等.酶制剂EA-II和生物制剂BA-I对鲤肠道、肝胰脏的蛋白酶和淀粉酶活力的影响［J］.大连水产学院学报,1993,8（1）:79-82.

［24］钱曦,王桂芹,周洪琪,等.饲料蛋白水平及豆粕替代鱼粉比例对翘嘴红鲌消化酶活性的影响［J］.动物营养学报,2007（2）:182-187.

［25］李晋南,徐奇友,位莹莹,等.谷氨酰胺及其前体物对松浦镜鲤生长性能、体成分和血清生化指标的影响［J］.东北农业大学学报,2013,44（12）:119-125.

Effects of α-ketoglutarate Supplementation on Intestinal Morphology and Function of Songpu Mirror Carp（Cyprinus carpio Songpu）

LI Jin-nan1,WEI Yu-qiang2,XU Qi-you1,ZHANG Dong-mei1
（1.Heilongjiang River Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences,Harbin 150070,China; 2.College of Fisheries and Life Science,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China）

The aim of this study was to investigate the dietary effects of α-ketoglutarate（AKG）supplementation and protein source treatments on the intestinal morphology and function of Songpu mirror carp（Cyprinus carpio Songpu）.Four experimental diets were formulated to contain two protein sources（soybean meal or fish meal+soybean meal）and two levels of α-ketoglutarate（0%or 1.5%）. A total of 400 Songpu mirror carp with an average initial body weight of（217.93±0.78）g was divided into 4 groups reared in a recycling system and fed one of the four experimental diets at water temperature of 23℃for 10 weeks with 5 replicates per group and 20 fish per replicate.The results showed that fold height of hindgut and muscular thickness of foregut and Na+,K+-ATPase activity in foregut were significantly improved by AKG（P＜0.05）.However,there was no significant interaction influence of protein source and AKG on intestinal morphology and Na+,K+-ATPase activity（P＞0.05）.The activities of protease and lipase in foregut and midgut were shown to be significantly increased in the fish fed the diets containing the diets supplemented with AKG（P＜0.05）.There was significant interaction influence of protein source and AKG on protease activity in hindgut（P＜0.05）.It is concluded that supplementation of 1.5%AKG can promote intestine development and digestive enzyme activities in Songpu mirror carp.

α-ketoglutarate;Songpu mirror carp;intestinal morphology;digestive enzyme;Na+,K+-ATPase

S948

A

1005-3832（2016）04-0043-05

2016-04-05

中国水产科学研究院基本科研业务费（2014A08XK03）；现代农业产业技术体系建设专项（CARS-46）.

李晋南（1983-），女，助理研究员，博士，从事水产动物营养与饲料研究.E-mail:lijinnan123@163.com