人血清淀粉样蛋白A1原核表达及胶体金检测方法的建立

宋英林，赵玉环，褚春旭，张司晨，张晓

（1.长春理工大学校医院，长春 130022；2.长春理工大学生命科学技术学院，长春 130022）

人血清淀粉样蛋白A1原核表达及胶体金检测方法的建立

宋英林1，赵玉环2，褚春旭2，张司晨2，张晓2

（1.长春理工大学校医院，长春 130022；2.长春理工大学生命科学技术学院，长春 130022）

通过胶体金免疫层析技术建立一种特异、便捷、快速的SAA1定量检测新方法。利用大肠杆菌BL21（DE3）原核表达人血清淀粉样蛋白A1（SAA1），根据BL21（DE3）表达偏好性设计并合成SAA1蛋白基因片段，构建表达载体pET-28a-SAA1，采用CaCl2法制备BL21（DE3）感受态，热激转化法将pET-28a-SAA1转入到BL21（DE3）。经表达条件优化，获得重组蛋白最佳诱导表达条件：温度30℃，时间6h，转速180rpm/min，培养基pH 7.0，IPTG浓度0.4mM，诱导表达后目的蛋白经SDS-PAGE电泳鉴定，Ni柱纯化、透析、浓缩从而获得浓度为8.09mg/ml，纯度为85%的SAA1。同时，结合胶体金标记技术，建立了SAA1胶体金免疫层析试纸检测方法，线性范围0.16～500μg/ml，最低检测限0.16μg/ml，该研究为临床体外诊断SAA1快速检测提供技术基础。

人血清淀粉样蛋白A1；原核表达；胶体金免疫层析；定量检测

血清淀粉样蛋白A（SAA）是一种主要的急性时相反应蛋白，由肝细胞产生并释放至血液循环。目前，细菌、病毒感染、冠心病、动脉粥样硬化、肿瘤、急性移植排斥反应等疾病中均检测到血清SAA升高［1-3］。作为新型检测指标物，SAA正受到学者及临床医学越来越多的关注。

研究表明，人血清SAA在正常情况下表达水平较低，但在急性期感染状态下，比CRP更灵敏，其在血清中的浓度能够在极短时间内升高100～1000倍［4］。另外，SAA和CRP的比值与小儿感染性疾病的严重程度存在相关性，监测SAA/CRP比值比单独检测SAA或CRP具有更大的应用价值［5］。

人类Saa基因位于11号染色体短臂，包含4个基因：Saal、Saa2、Saa3和Saa4。与其它载脂蛋白相同，所有Saa基因均由4个外显子和3个内含子组成。根据体内表达情况，SAA分为两类：急性期SAA（acute SAA，A-SAA）和组成型SAA（constitutive SAA，C-SAA）。人类Saa家族中有2种基因编码表达A-SAA，即Saa1和Saa2。Saa3基因由于在第3个外显子（第41个密码子处）有1个碱基插入，产生编码位移，导致在第43个密码子处产生翻译终止信号，属于假基因。C-SAA是Saa4在肝内低水平表达的SAA蛋白分子［6］。SAA1由104个氨基酸构成，其前端76个氨基酸被酶切后为淀粉样蛋白A。SAA1初级结构中某些氨基酸序列与其结合HDL、致淀粉样纤维原形成及细胞粘黏等功能有关。其二级结构为典型的球蛋白分子，具有仅螺旋和B折叠，并含有钙离子和脂质结合位点［7］。

SAA1在体内具有多种功能［8］，参与机体各种生理、病理反应。主要包括：参与内毒素解毒以及胆固醇代谢和转移［9］；抑制免疫反应［10］、血小板聚集、淋巴细胞和血管内皮细胞的增殖及趋化肽N甲酰-甲硫氨酰-亮氨酰苯丙氨酸（fLMP）诱导的中性粒细胞反应；诱导基质金属蛋白酶表达、前列腺素I的合成及细胞的黏附、迁移和浸润等［11］。

目前，临床诊断SAA1的检测方法主要有放射性免疫测定法（RIA）、酶联免疫吸附法（ELISA）、免疫速率散射比浊法［12］、微球捕获酶免疫法（MEI A）等。检测试剂均为进口产品，具有较高敏感性和特异性，应用自动化大型仪器进行检测，大大提高了SAA1在临床疾病监测中的应用价值。但是目前国产成熟商品化SAA1检测试剂较少，价格高，因此对该项指标的临床检测尚未广泛应用。该项目采用胶体金免疫侧向层析技术［13］，同时，结合自主研发的胶体金检测仪可以实现SAA1胶体金免疫层析定量检测，提高了胶体金检测法的准确性。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

仪器：GeneSYU型凝胶成像系统（英国基因有限公司）；Life Touch型PCR仪（北京东方安诺生化科技有限公司）；胶体金检测仪器（长春理工大学）。

试剂：San Prep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒，San Prep柱式DNA胶回收试剂盒，pUCm-T Vector，羊抗鼠多抗IgG（上海生工）；SAA1单克隆抗体购于武汉华美生物工程有限公司，其它试剂均为分析纯，超纯水。

1.2 实验过程

1.2.1 原核表达载体pET-28a-SAA1的构建

根据大肠杆菌BL21（DE3）密码子偏好性合成了目的片段Saa1基因序列，同时包含Nde I和BamH I酶切位点，该基因片段与pUCm-T载体连接，构成质粒pUCm-T-SAA1。利用限制性内切酶Nde I和BamH I将质粒pUCm-T-SAA1和pET-28a进行双酶切，将目的片段与pET-28a连接，获得原核表达质粒pET-28a-SAA1［14］。然后，利用热激转化法将表达质粒转入BL21（DE3）感受态细胞中，涂平板，37℃恒温培养箱中过夜培养，挑取阳性克隆子置于LB液体培养基中37℃过夜培养，提取质粒进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.2.2 SAA1蛋白诱导表达

将-80℃保存的原核表达菌株活化，37℃，180rpm/min，过夜培养12h，LB液体培养基扩大培养2.5h，通过表达条件的优化，可溶性SAA1最佳诱导表达条件为温度30℃，时间6h，转速180r/min，IPTG浓度0.4mM，经诱导表达后用Ni离子亲和层析柱进行蛋白质的分离与纯化，蛋白产物置于磷酸盐缓冲溶液（PBS）透析20h，然后蔗糖浓缩8h。采用聚丙烯酰氨凝胶电泳（SDS-PAGE）对原核表达SAA1进行鉴定。然后采用考马斯亮兰法测定原核表达SAA1蛋白浓度。

1.2.3 胶体金纳米粒子制备

取100ml去离子水放入250ml锥形瓶中，磁力搅拌并加热至100℃，然后加入氯金酸和柠檬酸（按照体积比1∶1），加热计时8min，而后用去离子水定容至100ml。采用分光光度计测定制备胶体金最大吸收峰，扫描电子显微镜表征粒径、形状及分散度。

1.2.4 SAA1胶体金免疫层析试纸条制备

胶体金免疫层析试纸条制作是依次将样品垫、喷涂胶体金-抗体复合物的结合垫、喷涂SAA1包被单克隆抗体检测线（T线）与SAA1多克隆抗体质控线（C线）的NC膜和吸水纸分别贴于PVC板上，样品垫长度为2cm，结合垫长度为0.5cm，NC膜长度为2.5cm，吸水纸长度为2.0cm，然后用手功切条机将组装好的PVC板切为宽带0.4cm，即为制备的检测用试纸条。

胶体金的检测原理是将SAA1单抗与胶体金颗粒偶联，在硝酸纤维素膜（NC膜）上分别包被SAA1单克隆抗体作为T线，多克隆抗体作为C线，样品待检液在毛细层析作用下沿NC膜侧向流动，样品液中含有的待测抗原与结合垫上的抗体发生特异性免疫结合反应，形成抗原抗体复合物。当抗原抗体复合物迁移到达检测线时，被检测线胶体金标记抗体捕获，从而产生富集和截留，呈现出肉眼可见的紫红色，根据颜色有无可判断阴性或阳性。

1.2.5 建立标准曲线

将SAA1标准品分布稀释为0.16μg/ml、0.8μg/ ml、4μg/ml、20μg/ml、100μg/ml、500μg/ml；共制作36个检测卡，即每浓度6个检测卡。通过胶体金免疫层析检测仪检测胶体金吸光度，从而建立SAA1定量检测标准曲线。

1.2.6 批内和批间重复性

在同样的条件下，每批制作SAA1胶体金检测试纸条60条，分别做3批，考察用加有标准品的小牛血清（0.8μg/ml）进行检测。

1.2.7 方法学比对

461医院提供血清84份，利用市售ELISA方法SAA1检测试剂盒与本方法检测结果进行对比，判断本实验制备的免疫层析试纸条与市场检测试剂盒的相关性。

2 结果与讨论

2.1 SAA1原核表达及纯化

利用实验部分将构建成功的pUCm-T-SAA1载体通过限制性内切酶Nde I和BamH I将SAA1片段酶切下来与通过限制性内切酶Nde I和BamH I酶切的空质粒pET28a，连接成功，转化后获得多个阳性克隆，通过PCR扩增鉴定结果如图1所示，其测序结果如图2所示，图中为送去上海生工测序出的基因序列，与合成的目的基因序列一致。结果表明已经成功构建pET28a-SAA1。

如图1所示，孔道1，2：DNA的标准Marker；孔道3，4，5，6：SAA1目的片断。

图1 PCR鉴定电泳图

图2 测序结果图

将构建成功的表达载体pET28a-SAA1热激转化入大肠杆菌BL21（DE3）中，以Kan抗性培养基平板筛选转化子，利用LB液体培养基培养阳性转化子，进行诱导表达。重组表达载体pET28a-SAA1成功表达可溶性SAA1蛋白，其SDS-PAGE鉴定结果如图3所示，对应的SDS-PAGE实验结果中，同样显示出明亮条带，其大小在14kD左右，以上结果均表明SAA1获得了表达。

图3 SDS-PAGE蛋白电泳图

如图3所示，孔道1：蛋白分子量Marker；孔道2：纯化样品；孔道3：未纯化样品；孔道4：洗杂液经Ni离子亲和层析纯化后，采用考马斯亮兰法测定目的蛋白浓度为8.09mg/ml。

2.2 胶体金制备

利用紫外分光光度计测得最大吸收峰在528nm处，从而确定胶体金颗粒粒径大约在40nm左右，利用透射电镜来鉴定胶体金粒径的大小、形状及分散度的情况，并进行合理的分析。所制备的胶体金颗粒分散均匀，粒径的大小为40nm，能满足实验需求。如图4所示。

图4 胶体金扫描电子显微镜的表征

2.3 SAA1标准曲线

SAA1标准品稀释系列梯度浓度，采用上述制备的胶体金免疫检测试机卡对标准样品进行测定，检测吸收光强度，以吸光度为纵坐标，以SAA1标准品浓度为横坐标，采用EXCEL软件建立标准曲线，结果如图5所示，在0.16～500μg/ml范围内，吸光度值与SAA1标准品浓度呈正相关，线性方程为y= 0.261ln（x）+0.6026，相关系数R2＞0.99，其目测法检出限为0.8μg/ml，自制胶体金检测仪器检出限达到0.16μg/ml。

图5 SAA1的标准曲线图

2.4 批内和批间重复性测定

采用上述方法分别制备3批，每批次60个检测用试纸条，每批试纸条检测30份小牛血清阳性样本（其中添加了0.8ng/ml SAA1标准品）和小牛血清阴性样本。检测结果如表1所示，阳性符合率与阴性符合率均为100%，说明SAA1胶体金试纸条检测重复性良好。

表1 SAA1胶体金免疫试纸条批内和批间重复性测定

2.5 方法学比对

采用市售标准Elisa检测试剂盒与本文制备的胶体金免疫试机卡同时对45例患者血清和39例健康人血清中SAA1含量进行测定，检测结果如表2所示，两种检测方法的阳性结果符合率为97.8%（44/45），阴性结果符合率为100%（39/39）。

表2 两种SAA1检测方法对比

3 结论

该研究通过热击法将重组表达载体转入至BL21大肠杆菌中，成功构建了人血清淀粉样蛋白A1重组表达工程菌pET-28a-SAA1（BL21）。

初步对目的基因进行诱导表达，SDS-PAGE蛋白电泳结果表明在总蛋白及可溶性蛋白液中均含有目的蛋白即重组人血清淀粉样蛋白A1。通过实验获得最佳诱导表达条件：温度30℃，时间6h，转速180rpm/min，培养基pH 7.0，IPTG浓度0.4mM。

同时，利用自制的基因重组SAA1蛋白，成功制备了人血清淀粉样蛋白A1胶体金免疫层析试纸条，线性范围0.16～500μg/ml，最低检测限0.16μg/ml。并对试纸条的性能进行研究，试纸条灵敏度高，特异性好，批间批内的差异性小，稳定性高，结合胶体金检测仪器进行检测，制做出了检测的标准曲线，其相关系数R2＞0.99，与市场免疫方法检出限相当。通过利用自制的检测仪器配套使用，实现定量准确快速检测，可广泛应用于基层社区医院和救灾现场，应用前景广阔。

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Prokaryotic Expression and Colloidal Gold Detection Method of Human Serum Amyloid A1

SONG Yinglin1，ZHAO Yuhuan2，CHU Chunxu2，ZHANG Sichen2，ZHANG Xiao2
（1.Hospital of Changchun University of Science and Technology，Changchun 130022；2.School of Life Science and Technology，Changchun University of Science and Technology，Changchun 130022）

To develop a specific，rapid，and convenient immune-chromatography assay（ICA）to quantitative detect the SAA1.Using Escherichia coli BL21（DE3）prokaryotic expression system of human serum amyloid A1（SAA1），according to BL21（DE3）gene fragment of Escherichia coli expressed preference for design and synthesis of SAA1 protein，the expression vector of pET-Pet28a-SAA1 was constructed，the preparation of Escherichia coli BL21 by CaCl2 method（DE3）electrocompeten，expression vector pET-28a-SAA1 into Escherichia coli BL21 by heat shock transformation method（DE3）.The optimization of expression conditions of recombinant protein，the optimal expression conditions：temperature 30，time 6h，medium speed 180r/min，pH 7，IPTG concentration of 0.4 mM，and then the expression of recombinant SAA1 protein after induced expression of protein，via using SDS-PAGE electrophoresis appraisal，Ni column purification，dialysis，and concentrated preparation for concentration of 8.09mg/ml，the purity of 85%SAA1 protein of high purity.At the same time，combining with colloidal gold marked technology，established the SAA1 colloidal gold immune chromatography test method，the linear is in the range of 0.16～500μg/ml，the minimum detection line 0.16μg/ml.The study provides a technical basis for the clinical diagnosis of SAA1 in vitro rapid detection and diagnosis.

human serum amyloid A1；prokaryotic expression；colloidal gold immuno chromatography；quantitative detection

R392

A

1672-9870（2016）06-0134-04

2016-08-02

宋英林（1963-），女，主任护师，E-mail：1013758138@qq.com

张晓（1979-），男，博士，副教授，E-mail：479336404@qq.com