提高籼稻恢复系花药培养绿苗分化率的研究

刘 凯,唐红生,严国红,孙明法

(江苏沿海地区农业科学研究所,江苏 盐城 224002)

提高籼稻恢复系花药培养绿苗分化率的研究

刘 凯,唐红生,严国红*,孙明法

(江苏沿海地区农业科学研究所,江苏 盐城 224002)

以MS培养基为对照,对比分析M8和N6两种培养基对籼稻恢复系花药培养出愈率的影响,并添加不同质量浓度的山梨醇、活性炭，研究其对愈伤组织绿苗分化率的影响。结果表明,4个籼稻恢复系在M8培养基中均具有最高的出愈率,介于20.97%～30.63%,极显著高于MS培养基；而在N6培养基上,出愈率介于10.77%～13.70%,仅盐恢559和盐恢888显著高于MS培养基。 随着山梨醇质量浓度升高,4个籼稻恢复系在M8分化培养基上的花药愈伤组织绿苗分化率增加,以30 g/L山梨醇处理最高,介于30.57%～36.77%,其次为20 g/L山梨醇处理,两者均极显著高于不添加山梨醇处理。随着活性炭质量浓度升高,4个籼稻恢复系在M8分化培养基上的花药愈伤组织绿苗分化率先增加后降低,总体均以1 g/L处理最高,介于21.38%～27.82%,2 g/L处理次之,两者均极显著高于不添加活性炭处理。

籼稻； 恢复系； 花药； 组织培养

花药培养是一种单倍体育种技术,目前已经成功应用于水稻育种中,它具有加快选择效率、缩短育种周期、快速创新种质材料等诸多优势。目前,花药培养技术在水稻不育系和恢复系的复壮提纯上应用较多,采用花药培养技术能使水稻育种材料中的优势基因高度纯和,防止品种退化[1-3]。然而植物组织培养存在很强的物种依赖性和基因型特异性。在栽培稻中,一般认为花药培养力的大小顺序为爪哇稻>籼粳杂种>粳稻>籼籼杂种>籼稻[4]。籼稻花药培养力一般偏低,平均出愈率只有0.5%左右,一般不超过5%,有些材料甚至不能诱导出愈伤组织[5]。一般情况下，花药培养力与接种材料密切相关,品种基因型是水稻花药诱导出愈率的重要影响因素[6-7]。黄翠红等[8]通过对6个不同籼型恢复系水稻进行花药培养发现,在同一基本培养基上由于植物生长调节剂配比水平不同,愈伤诱导率也会有所不同,尽管花药培养力的高低更多取决于水稻品种的基因型,但通过调整培养基中的植物生长调节剂配比也能在一定程度上促进其花药培养力的提高。此外,张志雄等[9]研究表明,在培养基中添加马铃薯、提取液、椰子汁、玉米汁等天然活性物质及水解酪蛋白、酵母汁、脯氨酸等多种有机添加物,对提高籼稻花药培养力均有明显效果。因此，对不同基因型籼稻材料进行花药培养技术体系优化具有重要的现实意义。为此,在以往研究的基础上,以4个籼稻恢复系盐恢559、盐恢269、盐恢888、盐恢1120 为试验材料,以MS、N6、M8为基本培养基,研究了添加不同质量浓度的山梨醇及活性炭对籼稻恢复系花药愈伤组织诱导、分化的影响,以优化籼稻恢复系花药培养条件,建立高效的花药培养技术体系。

1 材料和方法

1.1 供试水稻材料

盐恢559、盐恢269、盐恢888、盐恢1120均来自江苏沿海地区农业学研究所水稻室。材料种植于江苏沿海地区农业科学研究所南洋试验场,2014年5月5号播种,6月5号移栽,株行距为30 cm×13.33 cm,田间管理按常规方法。

1.2 培养基

1.2.1 诱导培养基 本研究以MS培养基为对照培养基,比较M8和N6两种培养基在相同条件下对籼稻恢复系花药出愈率的影响。其中,M8培养基配方参照阎丽娜等[10]的方法,N6培养基配方参照朱至清等[11]的方法,均附加30 g/L蔗糖、8 g/L琼脂粉、2 mg/L 2,4-D、0.5 mg/L水解酪蛋白和0.1 mg/L肌醇。

1.2.2 分化培养基 分化培养基采用M8培养基,其中添加30 g/L蔗糖、琼脂粉10 g/L、2 mg/L 6-BA、1 mg/L KT、2 mg/L NAA。并在此基础上,分别添加不同质量浓度的山梨醇(0、10、20、30 g/L)、活性炭(0、1、2、4 g/L),以研究两者对绿苗分化率的影响。

1.3 水稻花药培养

选取花粉分化正处在单核靠边期的籼稻穗子,4 ℃预处理7 d,然后经75%乙醇处理90 s,用0.1%氯化汞溶液浸泡5 min,再用无菌水漂洗4～5次,然后将穗子颖壳剪开,将花粉接种于诱导培养基上面。每瓶接种100枚左右,每个材料3瓶,重复3次,放入暗培养室于(26±2)℃条件下培养,接种30 d后记录出愈率,分化40 d后统计绿苗数目,计算绿苗分化率。出愈率=愈伤组织数/接种花药数×100%[12]；绿苗分化率=分化绿苗数/愈伤组织数×100%。

2 结果与分析

2.1 不同诱导培养基对籼稻恢复系花药出愈率的影响

由表1可知,4个籼稻恢复系在3种培养基上的出愈率差异显著,在M8培养基中均具有最高的出愈率,介于20.97%～30.63%,极显著高于对照；而在N6培养基上,出愈率介于10.77%～13.70%,仅盐恢559和盐恢888显著高于对照。对比M8和N6培养基,M8培养基更适合诱导籼稻恢复系花药产生愈伤组织,故后期分化率试验均采用M8培养基。另外,不同品种在 M8培养基上的出愈率差异很大,盐恢559和盐恢888出愈率相近,均较高；盐恢269和盐恢1120出愈率相近,均较低,表明籼稻花药培养受品种的基因型影响很大。

表1 不同诱导培养基对籼稻恢复系花药出愈率的影响 %

注:*、**分别表示与对照相比差异显著(P<0.05)、极显著(P<0.01),下同。

2.2 不同质量浓度山梨醇对籼稻恢复系花药培养绿苗分化率的影响

以M8为分化培养基,将前期产生的愈伤组织进行分化培养。由表2可知,总体上随着山梨醇质量浓度升高,M8分化培养基上籼稻恢复系花药培养绿苗分化率增加,以30 g/L山梨醇处理最高,介于30.57%～36.77%,其次为20 g/L山梨醇处理,两者均极显著高于不添加山梨醇处理；而10 g/L处理只有盐恢559和盐恢888的绿苗分化率显著高于不添加山梨醇处理,其余2个材料与不添加山梨醇处理差异不显著。这表明一定质量浓度的山梨醇作为培养基的碳源能够有效调节和维持愈伤组织细胞内的渗透压,从而促进愈伤组织分化。

表2 不同质量浓度山梨醇对籼稻恢复系花药培养绿苗分化率的影响 %

2.3 不同质量浓度的活性炭对籼稻恢复系花药培养绿苗分化率的影响

以M8为分化培养基,将前期产生的愈伤组织进行分化培养。由表3可知,随着活性炭质量浓度升高,M8分化培养基上籼稻恢复系花药培养绿苗分化率先增加后降低,总体均以1 g/L处理最高,介于21.38%～27.82%,2 g/L处理次之,两者均极显著高于不添加活性炭处理；而4 g/L处理只有盐恢559和盐恢888的绿苗分化率显著高于不添加活性炭处理,其余2个材料与不添加活性炭处理差异不显著,这可能是因为高浓度的活性炭能够大量吸附培养基中的植物生长调节剂、维生素和铁盐等外植体生长所必需的物质而抑制分化,降低了分化率。

表3 不同质量浓度活性炭对籼稻恢复系花药培养绿苗分化率的影响 %

3 结论与讨论

成功的花药培养在一定程度上依赖于培养基的选择,不同的培养基对不同基因型水稻材料有不同的培养效果,目前主要集中在M8、合5、SK3和N6等几种培养基上[13]。本研究采用M8和N6两种培养基对4个籼稻恢复系进行花药愈伤组织诱导研究发现,M8培养基获得了最高的出愈率,其中盐恢559和盐恢888相比其他2个恢复系获得了更高的出愈率和分化率,这表明籼稻花药培养依赖于水稻品种基因型。

培养基中的碳源主要是为培养物提供能量并维持细胞内的渗透压,不同种类和不同浓度的碳源都可以引起花药培养的变化。孙宗修等[14]利用60 g/L麦芽糖代替蔗糖作为碳源,发现其对籼稻出愈率和分化率均有较好的效果。本研究发现，在添加30 g/L山梨醇的M8分化培养基中,4个籼稻恢复系都获得了较高的分化率,极显著高于不添加山梨醇处理。这可能是由于培养基中添加山梨醇后能够有效维持细胞的生存与分化,其在愈伤组织细胞体内氧化分解形成蔗糖或麦芽糖,维持和调节离体培养细胞的渗透压,从而改善水稻花药愈伤组织的分化效率[15]。此外,在获得高的绿苗分化率的同时,伴随着愈伤组织的褐变,在培养基中添加活性炭能够有效降低愈伤组织的褐化率,创造适宜培养物生长的温和环境,但是高浓度的活性炭反而会抑制组织分化效率[16],这与本研究结果相似。

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Study on Improvement of Differentiation Rate of Green Plantlets in Anther Culture ofIndicaRestorer Lines

LIU Kai,TANG Hongsheng,YAN Guohong*,SUN Mingfa

(Coastal Areas of Jiangsu Institute of Agricultural Sciences,Yancheng 224002,China)

As MS medium was control,the effects of M8and N6mediums on anther callus induction rate ofindicarestorer lines were studied,as well as the differentiation rate ofindicarestorer lines were studied with different concentrations of sorbitol and activated carbon added in medium.The results showed that fourindicarestorer lines in M8medium had the highest rate of callus,ranging from 20.97% to 30.63%,significantly higher than that in MS medium;while in the N6medium,the rate of callus was 10.77%—13.70%,only Yanhui 559 and Yanhui 888 were significantly higher than that in MS medium.With the increase of concentration of sorbitol,the green plantlets differentiation rate of fourindicarestorer lines in the M8differentiation medium increased,reached the highest value with 30 g/L sorbitol,ranging from 30.57% to 36.77%,followed by 20 g/L sorbitol,both significantly higher than the treatment without sorbitol.With the increase of concentration of activated carbon,the green plantlets differentiation rate of fourindicarestorer lines in M8differentiation medium increased first and then decreased,reached the highest value with 1 g/L,ranging from 21.38% to 27.82%,followed by 2 g/L,both significantly higher than the treatment without activated carbon.

indica; restorer lines； anther； tissue culture

2016-04-20

江苏省自然科学基金项目(BK20161308)；盐城市农业科技创新专项引导资金项目(YK2015016)；国家科技支撑计划项目(2015BAD01B01)

刘 凯(1984-)，男，河南南阳人，助理研究员，硕士，主要从事水稻分子育种工作。E-mail：liukai11121@163.com

*通讯作者：严国红(1968-)，男，江苏盐城人，研究员，主要从事水稻育种与栽培工作。E-mail：guohongyc@163.com

S511.2+1

A

1004-3268(2016)10-0032-03