豫西地区禽源大肠杆菌的分离鉴定与耐药性分析

毛福超，郁 川，韩 璐，韩于佩，刘文慧，刘 静

(河南科技大学 动物科技学院 动物疫病与公共安全重点实验室，河南 洛阳 471003)

豫西地区禽源大肠杆菌的分离鉴定与耐药性分析

毛福超，郁 川*，韩 璐，韩于佩，刘文慧，刘 静

(河南科技大学 动物科技学院 动物疫病与公共安全重点实验室，河南 洛阳 471003)

为了解豫西地区禽源大肠杆菌的耐药情况，从豫西地区养鸡场采集130份疑似大肠杆菌病料样品，按常规方法分离细菌，对分离菌株进行生化试验、PCR鉴定、血清型鉴定及药敏试验。结果显示，共分离鉴定出98株鸡源大肠杆菌，确定86株细菌分属14个血清型，其中以O14、O141、O78、O88血清型为主，分别占分离菌株的20.93%、16.28%、13.95%、9.30%。利用K-B 法药敏试验检测大肠杆菌对20种抗生素的耐药性，结果表明，分离菌对复方新诺明的耐药性最高(95.92%)，其次为四环素(83.67%)、氨苄西林(81.63%)、萘啶酸(77.55%)、恩诺沙星(69.39%)，对亚胺培南和多黏菌素B敏感。大部分菌株具有多重耐药性，耐药种类最多的菌株对18种抗生素耐药，9～14重耐药菌株有76株，占77.55%。可见，豫西地区禽源大肠杆菌耐药现象十分严重，严重影响了禽类大肠杆菌病的防治。

大肠杆菌； 分离鉴定； 药敏试验； 耐药性分析

禽大肠杆菌病是由某些血清型大肠埃希氏杆菌引起的一类疾病的总称[1-5]。禽大肠杆菌血清型复杂，常与多种细菌或病毒混合感染，对养禽业危害严重[6-7]。近年来，禽大肠杆菌病已成为养鸡业生产中主要细菌性疾病之一，发病率和死亡率居高不下，给养鸡业造成了巨大的经济损失。临床上抗生素的滥用，不仅造成药物残留和畜产品品质下降，而且导致大肠杆菌耐药菌株不断增加和耐药谱扩大[8]。此外，耐药大肠杆菌能以人类和动物相重叠的共生菌为载体，转移抗生素耐药性基因，威胁着人类的健康[9]。豫西地区(洛阳、三门峡、平顶山等地区)是河南省家禽主要养殖区之一，但目前对该区域禽大肠杆菌病流行病学研究较少。为此，本研究对该区域部分养鸡场进行了大肠杆菌的病原分离鉴定及药物敏感性试验，以期了解该病的流行情况，旨在为指导临床用药、制定科学的防治措施提供参考。

1 材料和方法

1.1 样品来源

2014年于豫西地区规模化鸡场采集疑似大肠杆菌感染的病死鸡肝脏和脾脏等脏器，共130份样品。

1.2 主要菌株、试剂和培养基

大肠埃希氏菌ATCC2592、大肠杆菌的标准O血清均购自中国兽医药品监察所。氨苄西林、氯霉素、复方新诺明、多黏菌素、环丙沙星、氧氟沙星、萘啶酸、恩诺沙星、诺氟沙星、四环素、庆大霉素、卡那霉素、阿米卡星、链霉素、安曲南、亚胺培南、头孢曲松、头孢噻肟、头孢他啶、阿莫西林20种药敏纸片及各种生化试剂购自杭州天和微生物试剂有限公司。伊红美蓝琼脂培养基、麦康凯琼脂、革兰氏染色液及微量生化试验管及试剂购自广东环凯微生物科技有限公司。

1.3 禽源大肠杆菌的分离鉴定

1.3.1 细菌的分离纯化 无菌采取病死鸡的病料，接种于肉汤培养基，37 ℃培养18～24 h，然后划线接种于麦康凯培养基中，37 ℃培养18～24 h，然后挑取单个红色、光滑菌落划线接种于伊红美蓝培养基中，37 ℃培养18～24 h。按常规方法涂片、革兰氏染色、镜检，观察菌落的形态特征。挑取单菌落划线接种于伊红美蓝琼脂培养基平板上，于37 ℃培养18～24 h，再挑取紫黑色带金属光泽的单菌落接种于普通肉汤，37 ℃培养18～24 h后，取菌落涂片、染色、镜检。确认纯培养物后，置于4 ℃冰箱保存[10]。

1.3.2 PCR鉴定 将分离纯化后的菌株按照煮沸法制备细菌DNA模板，以大肠杆菌phoA基因的特异性引物进行PCR鉴定[11]。引物序列为F： 5′-GATAAGCCCGCAGTCACCT-3′；R：5′-TCCCGTAACTCATCACCATCA-3′。扩增片段大小约为370 bp，引物由华大基因公司合成。

1.3.3 生化试验 按照参考文献[12]的方法进行细菌的糖类发酵试验、吲哚试验、MR 试验、VP 试验、枸橼酸盐利用试验和三糖铁试验。

1.4 血清型鉴定

采用玻板凝集反应对分离株进行血清型鉴定[13]。取分离纯化后的菌液和大肠杆菌单因子血清各10 μL 在玻板上混匀，30 s内出现明显凝集者为阳性反应。同时以菌液与0.5%石炭酸生理盐水混合物作对照，观察有无自凝现象。

1.5 药敏试验

以大肠埃希氏菌ATCC25922为药敏质控菌株，参照K-B纸片扩散法[14]，用无菌的棉签蘸取鸡大肠杆菌的肉汤培养物，均匀涂布到LB平板的表面。再将药敏纸片贴到LB琼脂平板的表面，37 ℃培养18 h 后，测量抑菌圈的大小。

2 结果与分析

2.1 大肠杆菌分离鉴定结果

共分离到98株大肠杆菌疑似菌株。分离菌株能够分解乳糖、甘露醇、葡萄糖和麦芽糖产酸产气，绝大部分能分解阿拉伯糖，部分能分解蔗糖，VP试验阴性，MR试验阳性，硫化氰试验阴性，枸橼酸盐试验阴性，吲哚试验阳性，三糖铁琼脂由红色变黄色，底部没有黑色沉淀出现，符合大肠杆菌的生化特征。经大肠杆菌特异性引物PCR 鉴定，能扩增到约372 bp大小的条带。综上，分离菌株均判定为大肠杆菌。

2.2 大肠杆菌血清型鉴定结果

对分离的98株鸡源大肠杆菌菌株进行O 因子血清鉴定，共鉴定出86株分离株的血清型，分属于 14个血清型(表1)， 分别为：O14、O141、O78、O88、O157、O8、O147、O74、O149、O2、O1、O15、O111、O115，另外有12株因未出现玻板凝集反应或自凝而未能定型。血清型鉴定结果表明，优势血清型为O14、O141、O78、O88，这4种血清型菌株合计52株，占血清型定型菌株的60.47%，其次为O157、O8、O147、O74、O149，其他血清型菌株数量较少。

表1 98株禽源大肠杆菌的14种血清型分布

注：括号内为占血清型定型菌株的百分比。

2.3 药敏试验结果

由表2可以看出，98株大肠杆菌分离株对20种抗生素呈现不同程度的耐药，其耐药率介于2.04～95.92%。其中，对复方新诺明的耐药性最高(95.92%)，其次为四环素(83.67%)、氨苄西林(81.63%)、萘啶酸(77.55%)、恩诺沙星(69.39%)，对亚胺培南和多黏菌素B敏感性较高。对多年来一直被推荐治疗大肠杆菌病的氨苄西林、阿莫西林、四环素、氯霉素和复方新诺明抗生素的耐药率为59.18%～95.92%。同时，大肠杆菌对同一类药物中不同药物的耐药性也存在较大的差异。在头孢类药物中，耐药率依次为头孢曲松(63.26%)、头孢他啶(51.02%)、头孢噻肟(40.82%)。在喹诺酮类药物中，耐药率依次为萘啶酸(77.55%)、恩诺沙星(69.39%)、环丙沙星(55.10%)、诺氟沙星(44.89%)、氧氟沙星(38.78%)。可见，大肠杆菌对7类抗生素药物的耐药性存在一定的差异，对新型β-内酰胺类药物亚胺培南及多黏菌素B有着较高的敏感性，对磺胺类、常用β-内酰胺类、氨基糖苷类、四环素类、喹诺酮类和氯霉素类均有较高耐药性。

表2 98株禽源大肠杆菌药敏试验结果

2.4 耐药谱分析结果

对分离的98株大肠杆菌的耐药性分析发现，大部分菌株均以多重耐药为主，最高可对18种抗生素耐药[有2株(2.04%)]，耐药9～14种的菌株最多，有76株(77.55%)， 对1～4种抗生素耐药的菌株有6株(6.12%)，对5～8种抗生素耐药的菌株有8株(8.16%)，对9～12种抗生素耐药菌株有50株(51.02%)，对13～16种抗生素耐药菌株有32株(32.65%)。

3 结论与讨论

本研究对豫西地区禽源大肠杆菌进行分离鉴定及药敏试验，初步了解了豫西地区的禽大肠杆菌病的流行状况及大肠杆菌的耐药情况。分离到98株禽源大肠杆菌菌株，共鉴定出86株分离株的血清型(14种)，优势血清型为O14、O141、O78、O88，占定型菌株的60.47%，其次为O157、O8、O147、O74、O149。白静等[15]报道的河南省禽源大肠杆菌优势血清型O78、O1、O2等；卢晓辉等[16]报道，河南省禽源大肠杆菌主要血清型为O141、O147、O149、O88、O78；刘远升等[17]报道，周口地区禽源大肠杆菌主要血清型为O1、O2、O20、O45、O78、O138。本研究试验结果与白静等[15]、卢晓辉等[16]报道的主要优势血清型结果不一致。由此可见，河南省大肠杆菌血清型比较复杂，且各地血清型种类存在差异，不同年份的流行菌株血清型不一致。因此，需要对大肠杆菌的流行情况和流行特征所产生的影响进行长期而深入的监测研究。

药敏试验结果表明，豫西地区临床分离的禽源大肠杆菌存在严重的耐药问题，且表现为普遍的交叉耐药和多重耐药。对多年来一直被推荐治疗大肠杆菌病的氨苄西林、阿莫西林、四环素、氯霉素和复方新诺明等抗生素耐药率为59.18%～95.92%，这与汪洋等[18]报道的洛阳地区鸡源大肠杆菌的耐药性结果基本一致。其中，复方新诺明、四环素、氨苄西林、萘啶酸、恩诺沙星对大部分大肠杆菌分离株基本已失去防治作用。这可能是由于这些抗生素价格低廉，抗菌谱广，养殖户长期大量使用这些药物进行预防和治疗，造成了对此类药物的广泛耐药。对亚胺培南和多黏菌素B有着较高的敏感性，主要是由于这类药物为近年来新研制药物，且价格较高，在兽医领域较少使用。

分离菌株多重耐药性严重，最多的耐18种抗生素，对9～14种抗生素耐药的菌株最多，占77.55%。导致大肠杆菌耐药性的原因主要是豫西地区大部分养殖户饲养规模小，饲养水平相对较低，使用抗菌药物不合理，甚至是滥用抗菌药物，再加上药物不规范等因素，造成大肠杆菌耐药质粒在自然界的复制和水平传播，产生越来越多的耐药菌株。因此，在饲养过程中必须禁止滥用抗生素，减轻对细菌的选择性压力，延缓细菌产生耐药性的速度。在治疗大肠杆菌病时，可先筛选高效敏感的药物进行治疗，以提高对本病的治愈率，同时要注意科学合理用药，在抗菌药物的选择上应考虑联合用药、交叉用药、轮换用药；建立健全大肠杆菌耐药性监测系统，定期对临床分离菌株进行抗菌药物敏感性监测，以便及时掌握大肠杆菌耐药性变化趋势，根据耐药性监测结果为临床上合理选用最佳抗菌药物、最佳剂量和最适疗程提供理论依据。

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Isolation,Identification and Drug Resistance Analysis ofEscherichiacolifrom Chickens in Western Henan Province

MAO Fuchao,YU Chuan*,HAN Lu,HAN Yupei,LIU Wenhui,LIU Jing

(The Key Laboratory of Animal Disease and Public Security,College of Animal Science and Technology,Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003,China)

In order to investigate the resistance ofEscherichiacoliisolated from chickens in western Henan province,a total of 130 samples of suspect ofEscherichiacoliwere examined for the presence ofEscherichiacolispecies.All bacteria were isolated by a conventional method,identificated via biochemical testing,PCR,serotyping and antimicrobial susceptibility test.98 strains ofE.coliwere separated and 86 strains were confirmed as belonging to 14 serum types.The chief serum types were O14,O141,O78and O88with the percentage of 20.93%,16.28%,13.95% and 9.30% respectively.The isolates were evaluated for antimicrobial sensitivity by K-B disc diffusion method against 20 antimicrobial drugs.AmongE.coliisolates,95.92%,83.67%,81.63%,77.55%,69.39% were resistant to sulfamethoxazole,tetracycline,ampicillin,nilidixic acid and enrofloxacin,respectively.Almost isolates ofE.coliwere susceptible to polymyxin B,imipenem.Most of isolates were multiple resistant strains.77.55% of the isolates (76) were resistant to 9—14 antimicrobial agents.This study revealed that the drug resistance of all isolates was a severe problem in western Henan province,which would seriously affect diagnosis and prevention ofE.coliin poultry.

E.coli; isolation and identification; antimicrobial susceptibility testing; antimicrobial resis-tance analysis

2015-07-10

国家自然科学基金项目(31302059)；河南科技大学SRTP项目(2015143)；河南科技大学博士启动基金项目(4025-13480064)

毛福超(1991-)，男，河南周口人，在读本科生，研究方向：动物疫病防控。E-mail:1798119803@qq.com

*通讯作者：郁 川(1985-)，男，河南安阳人，讲师，博士，主要从事动物疫病防控研究。E-mail:yu_chuan1985@163.com

S855.1

A

1004-3268(2016)01-0127-04