槟榔鲜果对小鼠体质量、生精细胞凋亡及脏器系数的影响

刘书伟，王 燕，胡劲召

(1.琼州学院 热带生物与农学院，海南 三亚 572022； 2.琼州学院 热带生态环境保护学院，海南 三亚 572022)

槟榔鲜果对小鼠体质量、生精细胞凋亡及脏器系数的影响

刘书伟1，王 燕2*，胡劲召2

(1.琼州学院 热带生物与农学院，海南 三亚 572022； 2.琼州学院 热带生态环境保护学院，海南 三亚 572022)

为探索槟榔鲜果的毒性作用，将槟榔鲜果果皮、果仁和全槟榔的水提液及生理盐水(对照)对KM小鼠每天进行1次灌胃处理，连续13 d，测定小鼠的体质量、存活率、生精细胞凋亡指数、Bcl-2与Bax蛋白表达量及脏器系数。结果表明，果仁处理和全槟榔处理的小鼠体质量随着处理天数的增加呈下降趋势，果皮处理无明显影响；对照和果皮处理的小鼠存活率均为100%，全槟榔和果仁处理分别为55.56%和0；果仁和全槟榔处理的生精细胞凋亡指数分别为1.61%和0.96%，均极显著高于果皮处理和对照；果仁处理的Bax蛋白的表达水平明显增强,Bcl-2蛋白的表达水平明显下降。可见，槟榔鲜果水提液对小鼠所产生的毒性效应主要来源于果仁，果皮对小鼠无明显影响，全槟榔处理介于二者之间。

槟榔鲜果； 毒性； 小鼠； 细胞凋亡； 体质量； 脏器系数

槟榔(ArecacatechuL.)是棕榈科(Palmaceae)槟榔属(Areca)的热带常绿乔木，也是一种药食同源植物[1]，槟榔果实位居我国四大南药(槟榔、砂仁、益智、巴戟)之首，《得配本草》中记载：槟榔可“治泻痢，破滞气，攻坚积，止诸痛，消痰癖，杀三虫，除水胀，疗瘴疟”[2]。槟榔除用于嚼食外，也是传统驱虫药，临床上可添加于饲料中治疗犬、猪和牛绦虫等[3-6]，犬、猪和鸡蛔虫等[4,7-8]，还可治疗钩虫、蛲虫、血吸虫病等[9-10]。槟榔具有理气消积之功，可治疗牲畜的食积气滞、腹痛胀满便秘等[11-15]。此外，槟榔还有抑菌、抗抑郁、抗疲劳、抗氧化等多种功能。但2003年国际癌症研究中心(IARC)正式认定槟榔为一级致癌物[16]，槟榔使用的安全性受到质疑，国内外学者对槟榔的药理、毒副作用机制及新产品开发等方面进行了一定研究，但研究大多集中在槟榔生物碱的药理及毒性作用方面，对鲜果槟榔的原液提取物研究较少。为全面评价槟榔鲜果的毒性状况，本研究通过分析槟榔鲜果不同部位的水提液对小鼠进行经口灌胃后其身体指标的变化状况，初步探讨槟榔鲜果水提液对小鼠的毒性作用，为槟榔在兽药学领域的进一步开发、应用提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 供试动物

供试动物为SPF级KM小白鼠，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，小鼠生产许可证号为SCXK(湘) 2013-0004。动物引入后，置于三亚市功能槟榔研究重点实验室动物房养殖，喂养SPF级小鼠专用维持饲料，自由饮水采食，适应环境7 d，在小鼠适应的过程中，观察小鼠的综合状况，选取表现正常和大小均匀一致的小鼠待用，体质量(40±1) g。室内温度为(22±3)℃，相对湿度为60%～70%，光照为12 h/d。

1.2 槟榔材料及制备

槟榔果采摘于海南省三亚市吉阳区农民的槟榔种植园，茎部带宿萼，剖开槟榔有未成熟瘦长形种子，其外形椭圆、匀称，横向直径3～4 cm，光泽较好、颜色纯正，纵向直径5～6 cm。采摘后用保鲜膜包裹，及时运到实验室冷藏待用。

挑选均匀一致的槟榔鲜果清洗干净后晾干，取部分槟榔沿中轴纵向切开，将果皮和果仁分开待用，并留适量完整槟榔做全槟榔处理，将果仁、果皮和全槟榔分别称质量。将槟榔果皮切小块并加等质量的蒸馏水，用研磨机粉碎研磨5 min，静置水提待用，全槟榔采用同样方法处理；槟榔果仁机械压碎(不可用粉碎机粉碎，粉碎后呈糊状，不易过滤)，然后加入等质量的蒸馏水静置。全部水提4 h后用双层纱布过滤，将滤液分别置于经消毒后的离心管中，以5 000 r/min离心10 min，然后采用0.22 μm除菌过滤膜过滤，滤液即为供试水提液，3种水提液分别为：全槟榔水提液、果仁水提液和果皮水提液。水提液现用现制，2 h内处理完毕。

1.3 试验设计

按照食品毒理学实验室操作规范(GB 15193—2014)进行试验，选取36只健康小白鼠，随机分为4个处理，即全槟榔处理、果仁处理、果皮处理和生理盐水处理(对照，CK)。小鼠禁食8 h后称其体质量，按体质量大小灌胃给药，灌胃剂量为15 mL/kg，给药后禁食1 h，自由采食和饮水，连续灌胃13 d。为防止小鼠相互伤害，小鼠均为单笼饲养。

1.4 测定指标

1.4.1 体质量 试验期间，每天测量小鼠灌胃前体质量，观察记录存活状况。

1.4.2 生精细胞凋亡检测 试验期满，麻醉脱颈椎处死小鼠，迅速摘取雄性双侧睾丸，采用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)检测。在荧光显微镜下观察小鼠睾丸组织切片，细胞核中有棕黄色颗粒且背景清晰者为阳性细胞，每张切片选取20个视野计数总的生精细胞凋亡数，并计算生精细胞凋亡指数。

1.4.3 免疫组织化学检测睾丸组织Bax和Bcl-2蛋白的表达 检测参照姜卓等[17]的方法。采用10%的中性甲醛固定小鼠睾丸组织，铬明矾处理切片，石蜡包埋、切片、展片、烘片、脱蜡等处理后分别用武汉博士德生物工程有限公司的Bax、Bcl-2蛋白检测试剂盒进行一系列操作，采用JD-801形态学显微图像分析系统进行分析。

1.4.4 脏器系数 测定小鼠肺脏、肝脏、脾脏、睾丸、心脏和肾脏的质量以及体质量，各脏器与体质量的比值即为各脏器的脏器系数。

1.5 数据处理

使用SPSS 19.0软件进行差异性统计分析，结果用平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 不同处理对小鼠体质量和存活率的影响

从表1可看出，4个处理供试小鼠初始体质量差异不显著；随着灌胃天数的持续，全槟榔处理和果仁处理小鼠的体质量均呈现逐渐降低的趋势，从第3天开始全槟榔处理与果仁处理达到显著差异水平，与CK和果皮处理也均达到显著差异水平；果皮处理和CK体质量均呈增加的趋势，且两者差异不显著。不同处理小鼠存活状况不同，果仁处理小鼠死亡情况最为严重，在灌胃的第2天、第3天、第4天，小鼠分别死亡2只、4只、2只，第5天灌胃后2 h该处理小鼠全部死亡，其存活率为0；全槟榔处理在灌胃的第9天小鼠开始出现死亡，至试验期满死亡4只，存活率为55.56%；CK和果皮处理小鼠没有出现死亡现象，即存活率均为100%。可见，果仁处理会急剧降低小鼠的体质量并可将其全部致死，全槟榔处理会导致小鼠体质量逐渐降低且出现部分死亡现象，果皮处理对小鼠体质量无不良影响且无小鼠死亡。

表1 不同处理对小鼠体质量的影响

注：同列数据不同小写字母表示在0.05水平差异显著。表中空白表示该处理小鼠已全部死亡。

2.2 不同处理对小鼠睾丸曲细精管中生精细胞凋亡的影响

图1显示，与对照组相比，3个槟榔处理的小鼠生精细胞阳性表达细胞增多，其中果仁处理生精细胞凋亡指数最高且极显著高于其他处理，是CK凋亡指数的12.38倍；全槟榔处理凋亡指数为0.96%，极显著高于果皮处理和CK，是CK的7.38倍；果皮处理与CK差异不显著，其凋亡指数仅高于CK 0.02个百分点。说明果仁和全槟榔处理特别是果仁处理对小鼠生殖器官损伤较大，为维持小鼠内环境的稳定，生精细胞凋亡较多，这可能会使小鼠体内缺少精子；果皮处理对小鼠生殖器官损伤较小。

不同小写字母表示在0.05水平差异显著，不同大写字母表示在0.01水平差异显著图1 不同处理对小鼠睾丸生精细胞凋亡指数的影响

2.3 不同处理对小鼠睾丸生精细胞Bax和Bcl-2蛋白表达的影响

研究表明，Bax蛋白和Bcl-2蛋白均参与了生精细胞凋亡的过程[18-19]。Bax蛋白和Bcl-2蛋白在功能上相互对立，Bax蛋白促凋亡，Bcl-2蛋白抗凋亡， Bcl-2/Bax是决定细胞是否发生凋亡的重要指标。

由表2可看出，Bax蛋白和Bcl-2蛋白在各处理小鼠睾丸组织中均有不同程度的表达。果仁处理Bax蛋白表达阳性率最大且显著高于全槟榔处理、极显著高于果皮处理和CK；全槟榔处理Bax蛋白表达阳性率极显著高于果皮处理和CK；果皮处理Bax蛋白表达阳性率略高于CK，二者差异不显著。4个处理的Bcl-2蛋白表达阳性率也不同，其趋势与Bax蛋白相反。果仁处理Bcl-2/Bax最小，显著低于全槟榔处理，极显著低于果皮处理和CK，全槟榔、果皮处理和CK的值分别是果仁处理1.76倍、2.49倍和2.78倍。综上，在诱导小鼠睾丸细胞凋亡方面，果仁处理能显著增强凋亡蛋白Bax的表达，极显著地降低抗凋亡蛋白的表达，说明果仁处理具有较强的诱导细胞凋亡作用，全槟榔处理次之，果皮处理诱导作用不明显。

表2 不同处理对小鼠睾丸组织Bax蛋白和Bcl-2蛋白表达的影响

注：同列数据不同小写字母表示在0.05水平差异显著，不同大写字母表示在0.01水平差异显著。

2.4 不同处理对小鼠脏器系数的影响

脏器系数又称脏体比，正常动物各脏器与体质量的比值比较恒定，染毒后受损脏器的脏器系数发生变化，脏器系数增大说明脏器充血、水肿或增生肥大，脏器系数减小说明脏器萎缩或退行性改变。由表3可以看出，3个槟榔处理对小鼠肝脏、脾脏、睾丸和心脏影响不明显，脏器系数与CK差异均不显著；果皮处理对小鼠脏器系数影响最小，所有脏器系数与CK相比差异均不显著；全槟榔处理和果仁处理对小鼠肺脏和肾脏影响较大，其脏器系数与CK和果皮处理差异均显著，其中，果仁处理的脏器系数增加或减小的幅度最大。

表3 不同处理对小鼠脏器系数的影响

注：同列数据不同小写字母表示在0.05水平差异显著。

3 结论与讨论

本研究结果表明：(1)果仁和全槟榔处理特别是果仁处理对小鼠的体质量和存活率影响较大，果仁和全槟榔处理组小鼠体质量随处理天数增加均呈降低的趋势；在灌胃的第5天，果仁处理小鼠全部死亡，全槟榔处理在灌胃的第9天小鼠开始死亡，至试验期满死亡4只；而果皮处理和CK小鼠的体质量均呈增加的趋势，且两者差异不显著，小鼠无死亡现象。说明较高剂量的果仁提取液毒性较大，导致小鼠死亡。(2)槟榔鲜果水提液可诱导小鼠生精细胞凋亡，其中槟榔果仁处理的小鼠睾丸曲细精管中的生精细胞凋亡指数最高，全槟榔处理次之，并与其他处理达到极显著差异水平；果皮处理与CK差异不显著。说明槟榔特别是槟榔果仁诱导小鼠生精细胞凋亡指数增高，使生精过程发生障碍，从而影响其生殖功能，其具体机制还有待进一步探讨。(3)果仁和全槟榔处理对小鼠肺脏和肾脏影响较大，均使小鼠肺脏的脏器系数增加，使肾脏的脏器系数减小，与CK差异均显著，其中果仁处理增加或减小的幅度更大，说明这2个处理使小鼠肺部充血或水肿，使小鼠肾脏发生萎缩或退行性改变。提示槟榔果仁和全槟榔可能对免疫器官和呼吸器官有一定影响。综上所述，槟榔鲜果不同部位的水提液对小鼠毒害作用最严重的是槟榔果仁，其次为全槟榔(由果仁和果皮组成)，而果皮处理对小鼠的影响非常小。可见，槟榔毒性主要来源于果仁，果皮的毒性极微。

目前，普遍认为槟榔产生毒性作用的成分是槟榔生物碱，研究表明，生物碱大部分存在于槟榔种子中[20]，这与本研究结果一致。但其毒副作用机制并不清楚，因为槟榔含有多种生物碱，其生物学作用也较复杂。同时槟榔对雄性小鼠生精细胞、肺脏及肾脏的毒性作用应引起人们的注意，在临床的应用中，若使用槟榔制品添加于饲料中，应进一步研究其效果、最佳有效剂量及毒性等。本次试验研究得到的结果，仅提示在本试验条件下槟榔提取液对受试动物有一定的影响，至于其剂量-反应关系、作用机制均有待进一步探讨。

[1] 闻庆，庞玉新，杨全，等．海南岛药食同源植物资源及其开发利用现状[J]．广东药学院学报，2015，31(1)：126-131．

[2] 严洁,施雯,洪炜．得配本草[M]．上海：上海卫生出版社，1957．

[3] 肖啸，肖焰，沈学文，等．槟榔驱除犬绦虫试验效果观察[J]．中国畜牧兽医，2009(2)：135-137．

[4] 王连平，卢少达，张启祥，等．左旋咪唑与槟榔粉合用驱除犬弓首蛔虫和泡状带绦虫效果观察[J]．中兽医医药杂志，2005(3)：58-59．

[5] 田喜凤，戴建军，董路，等．槟榔南瓜子合剂对猪带绦虫作用的超微结构观察[J]．中国寄生虫病防治杂志，2002，15(6)：47-48,84．

[6] 杨全孝．槟榔加南瓜籽驱除犊牛绦虫[J]．中兽医医药杂志，1988(1)：52．

[7] 李献军．中药对离体猪蛔虫的疗效研究[J]．现代农业科技，2011(11)：328,330．

[8] 肖成山．槟榔汁加SDM治疗鸡蛔虫病效果好[J]．湖北畜牧兽医，1989(3)：50．

[9] 许正敏，李智山，温茂兴，等．槟榔对犬钩蚴体外作用的实验观察[J]．中国病原生物学杂志，2010(10)：767-768,805．

[10] 邹艳，丘继哲，曾庆仁，等．黄芪复合剂抗血吸虫作用的实验研究[J]．热带医学杂志，2010(6)：654-656,690．

[11] 王明兴．槟榔散治疗马属动物不完全阻塞性肠便秘[J]．中兽医医药杂志，2000(1)：31．[12] 陈发庭．槟榔在治疗马胃肠病中的应用[J]．兽医科技资料，1979(3)：43．

[13] 邹百仓，魏兰福，魏睦新．槟榔对功能性消化不良模型大鼠胃运动的影响[J]．中国中西医结合消化杂志，2003，11(1)：6-8．

[14] 王平．槟榔的促胃动力作用及其有效组分的探索[D]．南京：南京医科大学，2012．

[15] 杨建省，王秋菊．砂仁、槟榔、山楂等6味中草药促进胃肠蠕动作用的研究[J]．饲料博览，2013(2)：5-10．

[16] Gilani A H,Ghayur M N,Saify Z S,etal.Presence of cholinomimetic and acetylcholinesterase inhibitory constituents in betel nut[J].Life Sciences,2004,75(20):2377-2389.

[17] 姜卓，罗光彬，尹荣焕，等.喹乙醇对小鼠生精细胞Bax基因表达的影响[J]．河南农业科学，2008，37(3)：112-114.

[18] Saikumar P,Dong Z,Weinberg J M,etal.Mechanisms of cell death in hypoxia/reoxygenation injury[J].Oncogene,1998,17(25):3341-3349.

[19] Yang J,Liu X,Bhalla K,etal.Prevention of apoptosis by Bcl-2:Release of cytochrome c from mitochondria blocked[J].Science,1997,275(533):1129-1132.

[20] 周大鹏，王金梅，尹震花，等．HS-SPME-GC-MS分析槟榔果皮和种子的挥发性成分[J]．天然产物研究与开发，2012，24(12)：1782-1786．

Effects of Fresh Betelnut on Spermatogenic Cell Apoptosis,Viscera Coefficients and Body Weight of Mice

LIU Shuwei1,WANG Yan2*,HU Jinzhao2

(1.College of Tropical Biology and Agronomy,Qiongzhou University,Sanya 572022,China;2.College of Tropical Ecological Environmental Protection,Qiongzhou University,Sanya 572022,China)

To research the toxic effects of fresh betelnut,the mice were intragastricly administered with water extract solution from betelnut,peels and seeds of fresh betelnut once a day and observed for 13 d.Body weight,survival rate,spermatogenic cell index,Bcl-2,Bax and viscera coefficients of mice were measured.The results showed that the mice’s body weight of betelnut and seeds treatments decreased with the increase of days,and the treatment of peels had no bad effect on the mice.The survival rate of control(saline water) and peels treatments were 100%,betelnut and seeds treatments were 55.56% and 0.Spermatogenic cell apoptosis index of betelnut and seeds treatments were 0.96% and 1.61%,and had very significant difference with other treatments.The expression level of Bax protein of the seeds treatment was up regulated,but Bcl-2 protein was down regulated significantly.Therefore,toxic effects in mice mainly came from betelnut’seeds while peels almost had no effects,and the toxic effect of betelnut was between peels and betelnut’s seeds.

fresh betelnut; toxicity; mice; cell apoptosis; body weight; viscera coefficients

2015-07-01

海南省中药现代化专项项目(ZY201417)；三亚市功能槟榔研究重点实验室项目(L1411)；三亚市农业科技创新项目(2014NK28)；三亚市院地科技合作项目(2014YD16,2015YD29)

刘书伟(1978-)，男，河南平舆人，副教授，硕士，主要从事南药毒理、农产品加工研究及教学工作。 E-mail:hnlsw@163.com

*通讯作者：王 燕(1979-)，女，河南太康人，副教授，硕士，主要从事槟榔加工研究及相关教学工作。 E-mail:wysw119@163.com

时间：2016-02-02 17:36:14

S859.3

A

1004-3268(2016)02-0142-05

网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/41.1092.S.20160202.1736.001.html