石刁柏雄性偏向核质体DNA的克隆与分析

李书粉，李 旭，王冰肖，袁金红，邓传良，高武军

(河南师范大学 生命科学学院, 河南新乡 453007)



石刁柏雄性偏向核质体DNA的克隆与分析

李书粉，李 旭，王冰肖，袁金红，邓传良，高武军*

(河南师范大学 生命科学学院, 河南新乡 453007)

该研究以雌雄异株植物石刁柏为材料，利用基因组消减杂交技术对石刁柏雌雄核基因组中的性别差异核质体DNA(nuclear plastid DNA，NUPTs)进行了分离和分析。结果表明：(1)通过构建消减杂交文库共获得了52个雄性偏向序列，序列长度分布在63～297 bp之间，其中有19个差异序列属于叶绿体来源序列(命名为Ao1～Ao19)，且这些序列与石刁柏叶绿体基因组的相似性均大于84%，Ao19与石刁柏叶绿体基因组相似性为100%。(2)利用基因组半定量PCR对19个NUPTs序列的性别差异分析表明，有4条序列为稳定的雄性偏向NUPTs序列，分别为Ao1、Ao3、Ao10和Ao18。(3)序列比对表明，转移到核基因组的NUPTs主要来源于叶绿体基因组的反向重复区(包含IRa和IRb区)，说明石刁柏叶绿体基因组重复区序列更容易向核基因组进行转移形成雄性偏向的NUPTs序列。

石刁柏；性别差异；核质体DNA；雄性偏向

Cloning and Analysis of Male-biased Nuclear Integrants

植物细胞中存在细胞器基因组和细胞核基因组，细胞器DNA能够转移进入细胞核从而形成核质体DNA(nuclear integrants of plastid DNA，NUPTs)和核线粒体DNA(nuclear integrants of mitochondria DNA，NUMTs)[1]。其中，NUPTs主要是叶绿体起源的DNA转移到细胞核并整合到核基因组中形成的[2]。目前，在拟南芥(Arabidopsisthaliana)[3]、水稻(Oryzasativa)[4]、烟草(Nicotianatabacum)[5-6]等多个植物基因组中均发现存在NUPTs序列。核质体DNA的插入是真核生物基因组进化的重要动力[7]。一些研究表明，叶绿体来源的大片段DNA序列的插入会通过逐步衰减[8-9]或扩增来影响染色体的结构及演化过程[10]。

被子植物性染色体相对于哺乳动物来说在进化上较为年轻，因此是研究性染色体起源和演化的重要模式材料。研究表明，NUPTs的插入也可能参与了植物性染色体的演化过程。对雌雄异株植物酸模(Rumexacetosa)和白麦瓶草(Silenelatifolia)叶绿体基因组序列进行染色体定位发现，在这2个物种中核基因组中的叶绿体DNA主要累积在Y染色体上，甚至在酸模整条Y染色体上都散布有NUPTs序列[11]，而白麦瓶草Y染色体上的NUPTs主要分布于着丝粒位置[11]。这些有限的证据表明，NUPTs在Y染色体上并非随机分布，尤其是在白麦瓶草Y染色体上NUPTs分布于不易发生重复的着丝粒及其侧翼区域，说明NUPTs可能参与了XY性染色体之间重组抑制的形成。但是，目前由于该方面研究结果较少，且仅限于少数模式材料，因此NUPTs和植物性染色体之间的关系仍需要进一步研究。

石刁柏是一种重要的多年生雌雄异株草本植物，具有2n=2x=20条染色体，其性染色体X和Y同型[12]，表明其性染色体仍处于进化的早期阶段，是研究性染色体起源较为理想的材料之一。但是，石刁柏性染色体上是否存在NUPTs序列，其分布特征如何等仍未见报道。因此，本研究采用雌雄基因组消减杂交方法，分离分析石刁柏核基因组中的性别差异NUPTs序列，为进一步分析NUPTs与石刁柏性染色体起源和演化的关系提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 材 料

石刁柏(Asparagusofficinalis)品种“UC309”种植于河南师范大学生命科学学院实验基地，植株性别通过花器官鉴定。

1.2 方 法

1.2.1 石刁柏DNA提取及检测 石刁柏DNA用CTAB法进行提取，具体实验步骤参照文献[10]。

1.2.2 石刁柏雌雄基因组消减杂交 基因组消减杂交是通过驱赶DNA(driver)和检测DNA(tester)基因组之间的差异来分离不同基因型间差异序列的方法。在此，以过量的石刁柏雌性基因组DNA作为driver，适量的雄性基因组DNA作为tester，通过消减杂交以获得石刁柏雄性特异或偏向序列。具体步骤参照文献[13]进行。取25 μg雄株基因组DNA，加入MboI (10 U/μL) 2.5 μL，在金属浴37 ℃条件下处理9 h进行酶切，酶切后用纯化试剂盒进行回收。将酶切产物和125 μg雌性DNA(在沸水浴中放置60 min进行破碎)混合煮沸15 min变性。反应物室温下混合振动(100 r/min)复性72 h。将产物用氯仿抽提2次，乙醇沉淀。

将3×10-8μmol去磷酸化处理后的载体PUC119和3×10-7μmol消减产物进行连接转化。转化操作根据文献[14]进行。挑取阳性克隆进行菌落PCR鉴定，筛选插入片段为120 bp以上单克隆进行测序分析。

1.2.3 雌雄性别差异序列的斑点杂交 取1.5 μL菌落PCR扩增产物，分别以雌雄基因组DNA为探针，根据文献[15]方法进行斑点杂交。探针的标记按照Random Primer DNA Labeling Kit Ver.2.0(Takara，大连，中国)和DIG High Primer DNA Labeling and Detection Starter Kit试剂盒(Roche，Switzerland)说明书进行。根据斑点杂交结果，筛选出雌雄信号差异显著的单克隆进行测序。

1.2.4 NUPTs的鉴定及雌雄差异性验证 将测序得到的差异序列，用Blast进行同源搜索，筛选出与叶绿体基因组有关的序列。采用Primer 6设计引物(表1)，分别以石刁柏雌雄基因组为模板进行PCR扩增，验证其性别差异性。

表1 引物序列汇总表

根据所得序列设计引物进行基因组半定量分析，每对引物用3个雌性DNA模板和3个雄性DNA模板，以18S为内参。扩增总体系25 μL，分别加入模板DNA(质量浓度30 ng/μL)1.0 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP Mixture 1.5 μL，引物(10 μmol/L)各0.5 μL，Taq酶0.1 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，不同退火温度下1 min，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物用2.5%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.5 性别差异序列的基因组拷贝数分析 利用本实验室对石刁柏基因组测序数据[16]，运用bowtie2软件[17]对所得雄性偏向NUPTs进行拷贝数估计。

1.2.6 性别差异NUPTs序列的叶绿体基因组定位 采用DNAMAN软件对性别差异NUPTs序列和石刁柏叶绿体基因组进行序列比对，以确定这些性别差异NUPTs序列在石刁柏叶绿体基因组的定位，也即来源于叶绿体基因组的具体区域。

2 结果与分析

2.1 石刁柏雌雄株基因组DNA酶切及破碎

石刁柏雄性基因组DNA在100 μL体系下，经过MboI酶切9 h，电泳结果表明，酶切产物呈现均匀弥散状(图1，A)。说明酶切效果良好，可以用做Tester DNA。雌性基因组DNA经沸水浴处理 60 min，电泳结果显示，DNA破碎片段呈连续弥散，片段大小在250～1 000 bp之间，主亮带集中在500 bp左右(图1，B)，达到用做driver DNA的要求。

2.2 雌雄基因组DNA消减文库克隆及筛选

处理后的雄性DNA与雌性DNA消减杂交后，将消减杂交液与酶切纯化处理后的pUC119载体连接，转入大肠杆菌E.coliDH5α感受态细胞中，涂在含有氨苄青霉素的LB培养基平板上筛选后，共获得6 600个阳性克隆。用通用引物M13进行PCR扩增，获得2 600个片段长度在120 bp及以上的单一克隆，片段大小在100～450 bp之间(图2)。

2.3 阳性克隆的斑点杂交

为了进一步验证所获得阳性克隆的性别特异性，将452个重组单克隆菌液PCR扩增产物点在尼龙膜上，分别用雌雄基因组DNA为探针进行斑点杂交。共获得98个雄性特异阳性克隆(部分结果见图3)进行测序。测序结果利用DNAMAN软件去掉载体、引物序列、低质量序列和小于60 bp的序列后得到52条序列。其中，最长序列片段长度297 bp，最短序列片段长度63 bp。在52条差异序列中，33条为非叶绿体来源序列，19条序列是叶绿体来源序列，命名为Ao1～Ao19。所有的NUPTs序列石刁柏叶绿体基因组序列相似性在84%以上。

2.4 NUPTs的筛选与验证

为了进一步验证所获得的NUPTs是否是稳定的性别差异序列，利用基因组半定量PCR技术对19个NUPTs进行分析。结果发现，其中4个序列(Ao1、Ao3、Ao10、Ao18)是较为稳定的雄性偏向序列(图4)。

M. Trans2K marker；A. 1和2为酶切后的石刁柏雄性基因组DNA；B. 1和2为高温破碎后的石刁柏雌性基因组DNA图1 石刁柏雄性基因组DNA酶切(A)及雌性DNA破碎(B)电泳图M. Trans2K marker； A. 1 and 2 represent the genomic DNA of male asparagus after enzyme digestion；B. 1 and 2 represent the genomic DNA of female asparagus after high temperature boilingFig.1 The electrophorogram of enzyme digested male genomic DNA (A) and high temperature broken female genomic DNA (B) of asparagus

M为Trans 2K marker, 1～96为随机挑取的菌落图2 部分重组质粒的PCR扩增结果(以M13R和M13F为引物)M indicates Trans 2K marker；1-96 represent randomly selected coloniesFig.2 Partial results of PCR amplification for screening the positive recombinant clones (M13R and M13F as the primers)

A. 克隆与石刁柏雄性基因组DNA探针杂交；B. 克隆与石刁柏雌性基因组DNA探针杂交；箭头所示为雄性基因组中显著富集的克隆图3 部分消减杂交克隆产物的斑点杂交检测A. The results of clones hybridized with asparagus male genomic DNA probe; B. The results of clones hybridized with asparagus female genomic DNA probe; Arrows represent the clones with preference in male asparagus genomeFig.3 Dot blot hybridization of the clones screened by substractive hybridization (only partial results were shown)

2.5 NUPTs在基因组中的拷贝数估计

为了分析所获得的4个雌雄基因组差异序列是否属于重复序列，利用本实验室石刁柏基因组测序的数据进行拷贝数估计后发现，Ao1、Ao3、Ao10和Ao18的每单倍基因组拷贝数分别为2 514、1 505、1 477和15(表2)，说明这些NUPTs属于高度重复序列，这也说明核基因组中性别差异的NUPTs在其插入基因组后发生了复制。

M. Trans2K marker；1～3为石刁柏雌性单株基因组DNA；4～6为石刁柏雄性单株基因组DNA图4 基因组半定量PCR扩增结果M. Trans2K marker；1-3 represent the genomic DNA of female asparagus individuals；4-6 represent the genomic DNA of male asparagus individualsFig.4 Genomic semi-quantitative PCR amplification results

序列Sequence石刁柏基因组Ao⁃genome总拷贝数Totalcopies每单倍体基因组的拷贝数Copies/1CAo1162582514Ao396751505Ao1095721477Ao189715

2.6 NUPTs的叶绿体基因组定位分析

为了进一步分析所获得的NUPTs序列在石刁柏叶绿体基因组的位置特征，将所获得的19个NUPTs在叶绿体基因组进行定位，结果发现19个性别差异NUPTs在叶绿体基因组上的分布并不是随机的，其中10个NUPTs都分布在叶绿体基因组的反向重复区(IR)(包含IRa和IRb区)，而在短单拷贝序列(SSC)及长单拷贝序列(LSC)区仅有5个NUPTs，说明叶绿体反向重复区序列更容易向核基因组进行转移，可能和该区域序列高拷贝数有关。

3 讨 论

研究表明，叶绿体基因组向核基因组进行转移会引起染色体或染色质结构的变化，且这些NUPTs在染色体上的分布具有位置特异性。在水稻中发现大多数染色体上NUPTs多分布于着丝粒区域[18-19]，且多数长序列NUPTs会随着核基因组的膨胀和收缩而出现被复制或被淘汰现象[19]。本研究从石刁柏核基因组中所发现的19个雌雄差异叶绿体序列中有4个为高拷贝的重复序列，说明叶绿体DNA序列在核基因组中的插入频率较高，且在NUPTs不断插入演化过程中形成多拷贝重复序列，但是基因组的膨胀是NUPTs拷贝数增加的结果还是原因仍不清楚。从进化上来说，石刁柏叶绿体许多基因也发生了向核基因组的迁移现象，而且这是一个伴随物种进化的持续过程。本研究通过NUPTs在叶绿体基因组上的位置分析发现，转移到核基因组上的DNA大部分来自于叶绿体反向重复区，表明石刁柏叶绿体基因组的重复区序列更容易发生细胞核细胞质之间的转移，这也可能是造成细胞核基因组中某些NUPTs高拷贝数的原因之一。

现代进化理论认为，原始性染色体的性别决定区的重组抑制是性染色体演化过程中最关键的一步[20-21]。正是这种重组抑制现象的出现加快了植物性染色体的演化过程，导致了异型性染色体的出现[22]。而一些反转座子和NUPTs等高拷贝重复序列的插入可以引起性染色体的异染色质化[23]。现有研究证据表明，植物的性染色体上积累有大量的包括NUPTs在内的重复序列[11, 24-25]，这些序列能够导致Y染色体异染色质化及功能的丧失[25-27]，形成了两条组成型异染色质的Y染色体[28]。目前，从技术上证明NUPTs等重复序列在染色体上插入所引起的异染色质化可以利用现代细胞学技术来实现。如利用高分辨率的DNA Fiber免疫荧光杂交技术来分析NUPTs邻近区域染色质的DNA甲基化及组蛋白修饰模式特征，并通过和同属雌雄同株近缘种的同源染色体进行比较能够获得更有价值的结果，为进一步分析NUPTs在植物性染色体演化中的作用提供重要的理论资料。

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(编辑:宋亚珍)

of Plastid DNA fromAsparagusofficinalis

LI Shufen, LI Xu, WANG Bingxiao, YUAN Jinhong, DENG Chuanliang, GAO Wujun*

(College of Life Sciences, Henan Normal University, Xinxiang, He’nan 453007, China)

In this study, male-biased NUPTs (nuclear integrants of plastid DNA) were isolated and analyzed in the genome ofAsparagusofficinalis, a dioecious plant, by using genome substractive hybridization method. (1) 52 male-biased sequences with size ranged from 63 bp to 297 bp were obtained from the substractive hybridization library. Among these sequences, 19 were originated from chloroplast genome, which were designated as Ao1-Ao19. These sequences all showed high similarity (>84%) with the corresponding sequences in asparagus chloroplast genome, while Ao19 showed 100% similarity with the corresponding sequence in the asparagus chloroplast genome. (2) Genome semi-quantitative PCR revealed that four (Ao1, Ao3, Ao10, and Ao18) out the 19 sequences were stable male-biased NUPTs. (3) Sequence alignment showed the NUPTs were mainly derived from the inverted repeat region (IR) (containing IRa and IRb) of the asparagus chloroplast genome, indicating that the sequences of IR region of chloroplast genome were more preferred to transfer to nuclear genome to form male-biased NUPTs sequences.

Asparagusofficinalis; sex difference; NUPTs; male-biased

1000-4025(2016)12-2385-06

10.7606/j.issn.1000-4025.2016.12.2385

2016-10-12;修改稿收到日期:2016-12-02

国家自然科学基金(31470334)；河南省高校科技创新团队支持计划(17IRTSTHN017)；河南省教育厅科学技术研究重点项目(13A180525)

李书粉(1983-)，女，博士，副教授，主要从事植物性别决定与分化机制研究。E-mail：lishufen83@163.com

*通信作者:高武军，教授，主要从事植物性别决定与分化机制研究。E-mail：gaowujun1@163.com

Q789

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