茶树谷丙转氨酶基因的克隆及其表达分析

崔 新，刘志薇，吴致君，李 辉，王文丽，庄 静

(南京农业大学 园艺学院，茶叶科学研究所，南京 210095)



茶树谷丙转氨酶基因的克隆及其表达分析

崔 新，刘志薇，吴致君，李 辉，王文丽，庄 静*

(南京农业大学 园艺学院，茶叶科学研究所，南京 210095)

该研究基于茶树的转录组数据，采用RT-PCR方法从茶树‘黄金芽’cDNA中克隆获得茶树谷丙转氨酶基因(CsAlaAT)，利用荧光定量PCR方法，对CsAlaAT在茶树材料‘迎霜’和‘黄金芽’不同组织、温度胁迫与激素处理的表达进行分析。结果显示：CsAlaAT基因开放阅读框长度为1 662 bp，编码553个氨基酸，含有天冬氨酸转氨酶家族(Aspartate aminotransferase family)典型的AAT-like保守结构域。多序列比对显示，该序列与多个相关物种的序列一致性达78.83%，与磷酸吡哆醛(PLP)结合的10个氨基酸残基以及第358位赖氨酸催化位点在物种间高度保守。茶树CsAlaAT蛋白属亲水性蛋白，相对分子质量为60 877.5 D，等电点为6.11，碱性、酸性、脂肪族和芳香族氨基酸比例分别为12%、11%、22%和8%，无序化特征不明显，与大麦HvAlaAT具有相似的三维结构。实时定量PCR分析表明，CsAlaAT在茶树‘迎霜’和‘黄金芽’中的表达均具有组织特异性，且均在根部的表达量最高；CsAlaAT响应高温(38 ℃)和低温(4 ℃)胁迫的表达上调；外源施用脱落酸(ABA)和赤霉素(GA)能够抑制茶树中CsAlaAT基因的表达。

茶树；谷丙转氨酶；多序列比对；温度胁迫；激素；表达分析

茶是世界三大无酒精饮料之一，茶树〔Camelliasinensis(Linn.) O．Kuntze．〕为山茶科(Theaceae)山茶属(CamelliaLinn.)多年生常绿木本植物[1-2]。作为一种重要的商业饮料作物，茶树在中国、肯尼亚、斯里兰卡、印度等地均有种植，栽培历史悠久[3-4]。茶叶中含有许多对人体健康有益的次级代谢物质，包括茶氨酸、茶多酚、咖啡因和芳香油等[5]。其中茶氨酸(Theanine，N-乙基-γ-L-谷氨酰胺)是茶树特征性非蛋白质氨基酸，由Sakato首次从绿茶叶片中提取出并命名为茶氨酸[6]。

茶氨酸具有焦糖的香味和类似于味精的鲜爽味，能中和茶汤中的苦涩感，是茶叶品质的重要影响因素之一。茶树氮素代谢途径中，氮素大部分以茶氨酸的形式进行储存和代谢[7-8]。茶氨酸的合成与分解，与茶树的呼吸代谢和某些物质的代谢有关，并与茶树碳氮代谢的调节和控制有关[9]。通过同位素标记研究证实茶树茶氨酸的代谢前体为谷氨酸和乙胺[7]，通过L-茶氨酸合成酶(TS)在ATP、mg2+、K+的催化下合成[10]。目前，与茶氨酸生物合成直接相关的酶已经有很多研究报道，然而其中鲜有对参与茶氨酸代谢前体合成的谷丙转氨酶的报道。

谷丙转氨酶(Alanine aminotransferase，AlaAT)又称为丙氨酸转移酶，是一种依赖磷酸吡哆醛(PLP)作为辅酶的转氨酶，广泛分布于动物、植物、真菌和一些细菌中[11]。在不同的物种中，谷丙转氨酶可分为2～6个亚型，通过亚细胞定位发现其亚型可分布于细胞质、线粒体和过氧化酶体中[12]。谷丙转氨酶可逆地催化丙酮酸和谷氨酸生成丙氨酸和戊酮二酸[13]，在茶树中这个可逆反应是茶氨酸代谢前体丙氨酸合成的主要途径，丙氨酸再通过丙氨酸脱羧酶(ADC)脱去羧基形成乙胺用于合成茶氨酸。

谷丙转氨酶在植物氮素同化、蛋白质合成和碳代谢中发挥重要作用。有研究表明，过表达OsAlaAT基因的水稻可显著提高产量[14]；Yang等[15]证实在低氧环境下，OsAlaAT基因参与调控水稻种子胚乳中淀粉的合成。谷丙转氨酶也与植物抵御非生物胁迫有关，在拟南芥中缺氧环境会诱导AtAlaAT的表达[16]；也有研究指出AlaAT的活性在植物经受干旱胁迫后的复水阶段轻微上升，协助植物恢复正常代谢[17]。

本研究从茶树品种‘黄金芽’(C.sinensisvar. Huangjinya)中克隆获得茶树谷丙转氨酶基因(CsAlaAT)，并采用生物信息学方法对其氨基酸序列进行序列比对等分析。同时采用荧光定量PCR方法，对茶树CsAlaAT基因在2个茶树材料‘迎霜’(C.sinensisvar. Yingshuang)和‘黄金芽’不同组织、不同温度胁迫及不同激素处理的表达分析，探讨了谷丙转氨酶的组织表达差异与温度胁迫下的响应，为后续茶树中谷丙转氨酶功能以及茶氨酸代谢的深入研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料及处理

供试茶树材料‘黄金芽’和‘迎霜’种植于南京农业大学茶叶科学研究所，为2年生扦插幼苗，于2016年春季选取正常生长无病害茶树植株的根、茎、嫩叶和成熟叶进行总RNA提取及cDNA合成。对正常植株分别进行温度胁迫处理与外源激素处理， 4 ℃、38 ℃、0.1 mmol/L ABA、1 mmol/L GA分别处理2、8、和24 h，提取叶片组织总RNA并反转录成cDNA，以未处理植株作为对照。另外，以茶树品种‘黄金芽’叶片的cDNA为模板进行茶树CsAlaAT基因克隆。

1.2 方 法

1.2.1 茶树CsAlaAT基因克隆 茶树总RNA按照Quick RNA Isolation Kit(北京华越洋生物科技有限公司)试剂盒操作说明提取，提取RNA样品浓度由微量紫外检测仪NanoDrop测定，RNA质量用12 g·L-1变性琼脂糖凝胶电泳来检测。cDNA合成按照 Prime Script RT reagent Kit(大连TaKaRa公司) 试剂盒操作说明完成。基于本实验室获得的茶树转录组数据[18]设计1对引物(5′-ATGTGGAAATTCGTAGCCGAC-3′和3′- ATCACGAAATTCATCCATGAA-5′)。以‘黄金芽’cDNA第一链为模板进行PCR扩增。扩增体系为20 μL体系：ddH2O 7 μL，ExTaqMix 10 μL，上下游引物各1 μL，模板1 μL。反应条件为:95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 20 s，共35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物用12 g·L-1琼脂糖凝胶电泳分离，切取目标胶块，参照DNA回收试剂盒说明书将其回收纯化，连接至pMD19-T载体，转入感受态大肠杆菌DH5α菌株，挑取阳性克隆菌液送至南京金斯瑞公司测序。

1.2.2 序列分析 利用NCBI网站相关程序(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)对获得的核苷酸和蛋白序列进行BLAST比对搜索和保守域预测。序列多重比对、组成成分和理化性质用DNAMAN 6.0和EXPASY(http://web.expasy.org/protparam/)软件完成；使用MEGA6[19]完成进化树测试和编辑并生成报告图形；利用Foldindex[20]程序和SOPMA[21]程序完成蛋白质无序化特性分析和二级结构预测。采用Swiss-model[22]软件进行蛋白质三维分子结构分析。荧光定量PCR的数据分析采用IBM SPSS Statistic 20和 Microsoft Excel2010软件制作完成。

1.2.3 茶树CsAlaAT基因的表达分析 荧光定量PCR按照SYBR PremixExTaq试剂盒(大连TaKaRa公司)操作说明进行。根据本克隆的‘黄金芽’CsAlaAT基因序列设计表达检测引物(5′-CGAGTCCTACGAGTCTTATTATGC-3′和3′-GGAGGCGTTGACAATAGAATG-5′)。每个处理设置3个生物学重复，并分别用茶树Actin基因和TBP基因作为内参，与目标基因一起扩增[23]。在Bio-CFX96 Real-time PCR System 中完成荧光定量PCR。扩增程序为：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，40个循环，然后利用 Bio-cfx manager进行溶解曲线分析，采用2-ΔΔCt法[24]进行结果分析。

2 结果与分析

2.1 茶树CsALaAT基因克隆

以‘黄金芽’叶片的cDNA为模板，扩增得到长约1 700 bp片段。序列分析结果表明，该片段含有1个长度为1 662 bp开放阅读框(ORF)，共编码553个氨基酸(图1)。

2.2 茶树CsAlaAT序列比对和进化分析

对茶树CsAlaAT基因推导氨基酸的保守域预测结果(图3，A)显示，第154～528位序列含有1个典型AAT-like保守结构域，该序列还包含磷酸吡哆醛(PLP)结合位点[25]和一个参与形成席夫碱(Schiffbase)或醛亚胺配体(aldimine intermediate)的催化残基第358位赖氨酸(Lys)[26]，以及形成二聚体多肽结合位点的8个氨基酸残基，以上特征表明CsAlaAT属于天冬氨酸转氨酶家族。

此外，将茶树CsAlaAT同大麦(Hordeumvulgare)、拟南芥(Arabidopsisthaliana)、油菜(Brassicanapus)、烟草(Nicotianatabacum)、水稻(Oryzasativa)、马铃薯(Solanumtuberosum)、玉米(Zeamays)的AlaAT氨基酸序列进行多重对比，结果显示一致性为78.83%。其中上述物种的AlaAT均含有AAT-like结构域，其中构成磷酸吡哆醛(PLP)结合位点的10个氨基酸残基，包括一个与PLP形成醛亚胺键的关键赖氨酸残基，在上述物种间一致，具有高度的保守性(图3，B)。

为了进一步分析茶树CsAlaAT的进化关系，对其进行Blast同源检索与比对，得到不同物种间与其相似程度较高的AlaAT蛋白氨基酸序列，选取毛果杨(Populustrichocarpa)、可可(Theobromacacao)、甜椒(Capsicumannuum)、烟草(N.tabacum)、芜菁(Brassicarapa)、咖啡(Coffeacanephora)、番茄(Solanumlycopersicum)、罂粟(Papaversomniferum)、棉花(Gossypiumhirsutum)、甜瓜(Cucumismelo)、马铃薯(S.tuberosum)、大豆(Glycinemax)、拟南芥(A.thaliana)、水稻(O.sativa)、大麦(H.vulgare)、油菜(B.napus)、玉米(Z.mays)的AlaAT氨基酸序列构建同源进化树。结果显示，茶树CsAlaAT氨基酸序列与咖啡、甜瓜等的进化关系较近，与水稻、玉米等的进化关系较远(图2)。

2.3 茶树CsAlaAT氨基酸组成及理化性质分析

根据茶树CsAlaAT氨基酸序列在BLAST同源检索与比对，获得不同植物中相似度较高的AlaAT氨基酸序列，利用ExPASy-ProtParam对其进行氨基酸序列组成及理化性质分析。结果显示(表1)，在这些植物中AlaAT蛋白残基数为481～575。相对分子质量为(5.2～6.3)×104；碱性氨基酸比重略多于酸性氨基酸，等电点范围为5.3～7.5之间。脂肪族氨基酸占比22%左右，芳香族占比8%；总平均疏水性(GRAVY)均为负值，表明这些蛋白均属于亲水性蛋白。

图1 茶树CsALaAT核苷酸和推导氨基酸序列Fig.1 Nucleotide acid and deduced amino acid sequences of CsAlaAT from tea plant

2.4 茶树CsAlaAT氨基酸序列的无序化分析

利用FoldIndex程序对CsAlaAT氨基酸序列进行了折叠的无序化分析。结果显示(图4)：序列中无序化区域共有2个，最大无序化区域含28个氨基酸，总的无序化氨基酸数目为42，无序化比例为7.59%；总体而言CsAlaAT氨基酸序列无序化不明显。

2.5 茶树CsAlaAT的二级结构和三级结构预测

从茶树CsAlaAT全序列的二级结构预测结果

可知(图5)，CsAlaAT蛋白由41.41%的α螺旋，16.09%的β-折叠，12.84%的β-转角和26.66%的随机卷曲组成。结果表明，α-螺旋是CsAlaAT的主要组成部分，而β转角和β-折叠则散布于CsAlaAT蛋白序列中。

图2 茶树CsAlaAT与其他物种氨基酸序列的系统进化树Fig.2 The phylogenetic tree of amino acid sequences of the CsAlaAT

以大麦HvAlaAT(PDB ID:3TCM)为模型，对CsAlaAT进行蛋白质三级结构建模分析，结果显示HvAlaAT与CsAlaAT的三级结构非常相似(图6)，一致性为78.38%。茶树CsAlaAT在细胞内以二聚体的形式存在，其结构域与HVAlaAT相比均包括蛋白质N端(3～63)、一个较小的αβ-结构域(氨基酸残基64～107，396～517)和一个较大的αβα-结构域(氨基酸残基107～395)，活化位点以及PLP加合物(PLP adduct)处于这两个结构域中间。

上划线部分为AAT-like结构域，下标三角形的为PLP结合位点，下标矩形的为催化位点图3 茶树CsAalAT保守域(A)及与其他物种氨基酸序列的多重对比(B)Upper score represents the AAT-like conserved domain; triangles represent the PLP binding sites; rectangle represents the catalytic residue respectivelyFig.3 The conserved domain (A) of CsAalAT and alignment of amino acid sequences from tea plant and other different plants (B)

序列图中下划线代表无序状态的氨基酸，无下划线代表有序状态的氨基酸，坐标图中正负数值分别表示蛋白的有序和无序状态图4 CsAlaAT折叠状态的分析Amino acids represented ordered and non-ordered regions are shown in non-underline and underline, respectively; Positive and negative numbers represent ordered and disordered protein, respectivelyFig.4 Prediction of the folding state of CsAlaAT

植物Plant名称Name登录号GenBankNo．总氨基酸数目Totalaminoacid/aa相对分子质量Molecularweight/D理论等电点pI各氨基酸比例Compositionofaminoacid/%碱性Basic酸性Acid脂肪族Aliphatic芳香族Aromatics总平均疏水性Grandaverageofhydropathicity茶树C．sinensisCsAlaAT55360877．56．111211228-0．209拟南芥A．thalianaAtAlaAT2NP＿565040．254059510．65．951312218-0．269咖啡C．canephoraCaAlaATCDO97792．148753518．95．441212228-0．213甜瓜C．meloCmAlaAT2XP＿008460348．151356307．16．251211228-0．176大豆G．maxGmAlaAT1ABW17196．148653320．65．311112218-0．213甜椒C．annuumCaAlaATAAR05449．148152793．25．291112238-0．147烟草N．tabacumNtAlaAT2XP＿016473669．154760127．46．011211218-0．233番茄S．lycopersicumSlAlaAT2XP＿004235527．157563179．27．541311228-0．184马铃薯S．tuberosumStAlaAT2XP＿006342897．154559613．75．891211218-0．219水稻O．sativaOsAlaATAAK52114．148452692．36．221111238-0．110油菜B．napusBnAlaATXP＿013744571．154059573．06．251312218-0．241玉米Z．maysZmAlaATAAC62456．148252997．76．291211229-0．165大麦H．vulgareHvAlaAT39575927350055135．76．061412228-0．214

蓝色. α-螺旋；红色. β-折叠；绿色. β-转角；粉色. 随机卷曲图5 茶树CsAlaAT的二级结构预测Blue. Alpha helix, Red. Extended strand, Green. Beta turn, Pink. Random coilFig.5 The secondary structure of the deduced CsAlaAT polypeptide

图6 茶树CsAlaAT的三维结构预测Fig.6 The three-dimension structures of CsAlaAT from tea plant

2.6 茶树CsAlaAT基因在茶树不同部位的表达分析

通过实时荧光定量PCR检测CsAlaAT基因在茶树‘迎霜’和‘黄金芽’不同部位的表达情况。结果显示，茶树CsAlaAT基因在‘迎霜’和‘黄金芽’中的表达模式较为相似，均在根部表达量最高(图7)。‘迎霜’和‘黄金芽’CsAlaAT基因表达量由高到低均为根、茎、成熟叶、幼叶；根的表达量显著高于其他3个部位，幼叶和成熟叶表达量较为接近。此外，CsAlaAT基因在‘黄金芽’根部的表达量显著高于在‘迎霜’根部的表达量，为‘迎霜’根部的26.3倍。

2.7 CsAlaAT基因不同温度和激素处理下的表达情况

茶树‘迎霜’在4 ℃低温、ABA处理和GA处理下，CsAlaAT表达量较对照均表现出一定程度下调，基本趋势为处理初的2 h左右表达量最低，随处理时间延长表达量有一定回升，但仍显著低于对照(图8，A)。‘黄金芽’与‘迎霜’的CsAlaAT基因在38 ℃高温处理下，表达量相对于对照均有上调，在处理2、8、24 h后的表达量分别为对照的1.7、1.1、

2.4倍和4.2、2.5、2.1倍(图8，B)。茶树品种‘黄金芽’，在4 ℃低温处理下，表达量相较对照有一定上调，在处理2、8、24 h后分别为对照的1.2、1.7和1.6倍(图8，C)。在ABA处理下，‘黄金芽’的CsAlaAT基因表达与‘迎霜’的表达模式相似，即处理最初下调最显著，随处理时间延长开始有一定回升。在GA处理下，‘黄金芽’的CsAlaAT在处理2 与8 h情况下，下调量并未达到显著水平，在持续处理24 h后，下调量达到显著水平(图8,D)。

不同小写字母表示同一品种不同组织的差异显著(P<0.05)图7 CsAlaAT基因在茶树不同组织的表达Different letters represent significant difference among tissues of two cultivarsFig.7 Expression analysis of AlaAT in different tissues

不同小写字母表示同一品种不同处理的差异显著(P<0.05)图8 CsAlaAT基因在不同处理下的表达Different letters represent significant difference among different treatments of two cultivars (P<0.05)Fig.8 Expression analysis of CsAlaAT under different stress treatments

3 讨 论

谷丙转氨酶是一类依赖磷酸吡哆醛作为辅酶的转氨酶类，其催化的可逆反应中可利用的底物有碳代谢中关键的戊酮二酸、丙酮酸，以及参与氮素同化及信号转导的谷氨酸。谷丙转氨酶在植物的碳氮代谢有着不可或缺的作用，研究也证实其可协助植物抵御胁迫[27-28]。本实验从茶树品种‘黄金芽’中克隆出长约1 700 bp片段，该片段含有1个典型的AAT-like保守结构域，属于天冬氨酸转氨酶超家族。与多种亲缘关系相近的植物AlaAT氨基酸序列具有较高的相似性和相近的理化性质。推导的三级结构与大麦HvAlaAT三级结构一致性较高，以二聚体的形式进行催化，参与形成希夫碱的活化位点第358位赖氨酸(Lys)残基在2个物种间保持一致。

‘黄金芽’和‘迎霜’不同组织和不同逆境处理下表达分析显示，茶树CsAlaAT基因表达具有组织特异性，均在根部表达量最高。其中‘黄金芽’根部表达量显著地高于‘迎霜’根部表达量。Rocha等[29]测量了谷丙转氨酶在大豆(Glycinemax)中的组织特异性表达，GmAlaAT在接种了根瘤菌的大豆植株的根部表达量最高，高于没接种根瘤菌的根部表达量，也高于在叶和豆荚中的表达量。这个结果同CSAlaAT在‘黄金芽’中的表达模式相似。接种根瘤菌可提高大豆的氮素同化率[30]，‘黄金芽’属白化茶树品种，具有氨基酸含量高，茶多酚和咖啡因量适中的特点[31]，推测其根部大量的茶氨酸合成和旺盛的氮素同化是CsAlaAT在根部表达量高的可能原因。

目前，对茶氨酸代谢相关的研究较多，然而对茶树谷丙转氨酶研究报道较少，对其在茶树碳氮代谢以及抵御胁迫中的作用和机理有待深入研究。对茶树谷丙转氨酶及其家族成员的研究，可作为一个新的角度来理解茶树茶氨酸代谢与碳氮代谢之间的联系以及其响应茶树非生物胁迫的分子机理。

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(编辑:宋亚珍)

Cloning and Expression Analysis of the Gene Encoding Alanine Aminotransferase inCamelliasinensis

CUI Xin, LIU Zhiwei, WU Zhijun, LI Hui, WANG Wenli, ZHUANG Jing*

(College of Horticulture, Tea Science Research Institute, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

Alanine aminotransferase (AlaAT) is a pyridoxal-5′-phosphate-dependent (PLP) enzyme which plays a critical role in linking carbon and nitrogen metabolism. AlaAT is also involved in plant responses to abiotic stress. In this study, based on the transcriptome data of tea plant, we clonedCsAlaATgene encoding alanine aminotransferase from cDNA of ‘Huangjinya’ by RT-PCR method. In addition, the expression profiles of theCsAlaATgene in different tissues and under extreme temperatures and hormone treatments in two tea plant varieties (‘Huangjinya’ and ‘Yingshuang’) were analyzed by quantitative real time PCR. Results showed that the length of open reading frame (ORF) ofCsAlaATgene was 1 662 bp, encoding 553 amino acids. CsAlaAT contains typical conserved AAT-like domain which belongs to Aspartate aminotransferase family. Multiple alignments of CsAlaAT with related plant species showed that the identity of them was 78.83%. The PLP binding sites and the catalytic residue of 358 Lys were highly conserved. The CsAlaAT is hydrophilic protein. Its theoretical relative molecular weight is 60 877.5 D. Theoretical isoelectric point is 6.11. Percentages of basic, acidic, aliphatic and aromatic amino acids were 12%, 11%, 22% and 8%, respectively. A three-dimension crystal structure of CsAlaAT was established on the basis of the HvAlaAT which share identity of 78.38% with CsAlaAT. Quantitative real-time PCR analysis of the expression profiles showed that theCsAlaATgene was tissue-specific expressed in two tea plant varieties ‘Huangjinya’ and ‘Yingshuang’. The highest expression level was found in the root. TheCsAlaATgene could respond to high temperature (38 ℃) and low temperature (4 ℃) treatments. Exogenous application of abscisic acid (ABA) and gibberellins (GA) could down-regulated theCsAlaAT.

Camelliasinensis; alanine aminotransferase; multiple alignment; temperature stress; hormone; expression profiles

1000-4025(2016)12-2361-09

10.7606/j.issn.1000-4025.2016.12.2361

2016-10-18;修改稿收到日期:2016-12-09

国家自然科学基金(31570691)

崔 新(1992-)，男，硕士研究生，主要从事茶树分子生物学研究。E-mail: 2015104091@njau.edu.cn

*通信作者:庄 静，教授，博士生导师,主要从事茶树遗传育种与茶树分子生物学研究。E-mail: zhuangjing@njau.edu.cn

Q785;Q786

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