疏松结缔组织铺片方法在组织学与胚胎学实验教学中应用与体会

宋军营　张　娜　潘晓丽　王　琦　吴耀松　蒋时红　张振强▲

1.河南中医药大学中医药免疫学实验室，河南郑州　450046；2.河南中医药大学，河南郑州　450046

疏松结缔组织铺片方法在组织学与胚胎学实验教学中应用与体会

宋军营1，2张娜2潘晓丽2王琦2吴耀松2蒋时红2张振强1，2▲

1.河南中医药大学中医药免疫学实验室，河南郑州450046；2.河南中医药大学，河南郑州450046

为了提高《组织学与胚胎学》的教学质量，培养学生的综合素质，在中医院校开展了“疏松结缔组织铺片法”的实验课教学。通过复合染色方法，可一张铺片呈现蓝、红、紫三种颜色，使得镜下能够观察到两种纤维和三种细胞。这种方法的实施不仅增强学生动手能力，而且能很好地了解疏松结缔组织中细胞的不同表型和分布，同时，既丰富组织学内容，把教学、科研连接一起，又达到提高实验教学质量的目的。

疏松结缔组织；铺片；实验教学；复合染色

［Abstract］To improve the teaching quality of histology and embryology，meet the students'desire for knowledge and train their overall quality，the experiment teaching methods of"loose connective tissue"was carried out in Chinese medicine colleges.Three colors:blue，red，purple were present in a piece of glass，two kinds of fibers and three kinds of cells were observed by themicroscope.The implementation of themethod is not only strengthen the student beginning ability，but also is a good understanding of different phenotypes and distribution of cells in loose connective tissue. Meanwhile，the contents of the histology are enriched，teaching and scientific research are connected together，and the goal of the experiment teaching quality is improved.

［Key words］Loose connective tissue；Stretched preparation；Experimental teaching；Compound staining

《组织学与胚胎学》这门课程是中医院校医学生较早接触的主要基础课之一，对于奠定相近基础学科的作用具有重要意义［1］。中医院校《组织学与胚胎学》教学模式是在理论教学的基础上，再通过实验教学着重对相应理论进行验证，实验教学中则一般采用理论教学结合切片示教型实验教学，即通过教师指导学生利用光学显微镜，观察切片标本的细胞、组织和器官等，并简单描绘出400倍下观察的部分标本图像。这对于研究微观形态结构、具有庞大的专业名词和概念及抽象三维立体结构的验证性学科来说，学生要想理解和掌握所学内容是远远不够的，所以加强实验课教学手段，使学生在实验课上获得形象化、具体化的感性认识。因此，实验课的教学质量对培养学生的学习兴趣和提高教学效果具有重要意义，直接影响后续课程的教学质量［2］。

▲

通讯作者

为了提高中医院校医学生的综合素质，响应学校最新提出的教学方法改革提案，我们对实验教学的内容和讲述方式进行创新：即在实验教学中开展制作疏松结缔组织铺片实验，由教师示范操作后划分成组的学生自己独立操作完成。疏松结缔组织铺片方法是比较常用的组织学技术，通过不同方法着色使其各种细胞和纤维显现出来，有助于对疏松结缔组织成份的认识。通过复合染色方法可一张铺片呈现蓝、红、紫三种颜色，使得镜下能够观察到两种纤维和三种细胞［3，4］。这种方法的实施不仅增强学生动手能力，而且能很好地了解疏松结缔组织中细胞的不同表型和分布，既丰富组织学内容，把教学、科研连接一起，又达到提高实验教学质量的目的，由此也改变了学生被动接受性学习和不利的创新能力培养，充分体现学生的主体作用，给学生提供多动手多动脑及进行创造性思维的机会［5］。

1　实验教学方法

根据2014年3月的预实验结果，4月完善实验设计。取健康日本大耳白兔（批准号：DWLL201403015）1只，体重2 kg，连续腹腔注射1%台盼蓝（美国sigma公司）3 d，然后第5天和第7天再注射，共注射5 d，每天1次；兔缘静脉注射20%乌拉糖溶液（美国sigma公司）麻醉（5 mL/kg），打开腹腔取皮下肠系膜铺于蜡盘上，用蛙钉固定；用20%福尔马林固定液（国药集团化学试剂有限公司）固定10～15 min（用时新配）；然后用蒸馏水水洗3次；用解剖剪剪成小块，分给学生（1块/人），用解剖针轻轻展开肠系膜薄层，借助于组织液黏附于载玻片上，使肠系膜展平完全铺开，尽量不要有重叠的部分；滴加碱性复红（北京索莱宝科技有限公司）溶液，放入40℃温箱内染15 min；出恒温箱（上海精密仪器公司）用蒸馏水水洗，再用95%酒精（国药集团化学试剂有限公司）分色1～2 min；分色后再次蒸馏水水洗，滴加偶氮卡红（北京索莱宝科技有限公司）溶液，在60℃温箱内复染1～2 min；出恒温箱后，直接入95%酒精液分色1～2 min；用无水乙醇脱水，用二甲苯（国药集团化学试剂有限公司）透明，最后滴加中性树胶封片，镜下观察。

2　学生实验结果分析

实验做的比较成功的铺片学生可在显微镜（日本Nikon）下观察到：巨噬细胞形态大小不一，但外形比较清楚，在纤维中间分布，细胞核较小而染色较深，主要呈圆形或椭圆形，在胞质中可以观察到粗大的蓝色吞噬颗粒；成纤维细胞相对数量较多，而且胞体呈梭形或星形，细胞核大，呈卵圆形，染色后呈浅红色，但胞质内无蓝色颗粒；肥大细胞呈椭圆形，胞质有大量细小颗粒呈浅紫红色；镜下看到数量较多呈红色的胶原纤维，有分支且粗细不等；而呈紫红色的弹力纤维数量较少，多数弹力纤维单根走行呈细丝状，在其断端卷曲成波浪形。根据数量和着色情况能够清晰分辨出弹力纤维和胶原纤维（染色时间短时胶原纤维较清晰，染色时间长时弹性纤维较清晰），这样的片子可以作为教学示片（封三图12）。

实验做的不成功的铺片会出现组织块重叠、时间把握不好（染色过度或染色过短），有的同学会在中间环节缺少个别步骤，使分色效果不好等，这些结果都不能很好地在显微镜下观察到实验要求的三种细胞和两种纤维。

3　讨论

3.1“疏松结缔组织铺片的实验制作”的教学心得

“疏松结缔组织铺片的实验制作”是一项常用的组织学技术，其各种细胞和纤维的清晰程度对疏松结缔组织成分的认识具有重要作用，而制作良好的标本是培养学生观察能力、提高学习兴趣和教学效果的必备条件，选择适当的实验材料和染色方法是提高制片质量的前提。一张理想的教学用疏松结缔组织铺片应具备达到以下几点：①所有要观察的细胞核清楚，着色清晰；巨噬细胞吞噬颗粒清晰，均匀分布于胞浆中，成纤维细胞数量明显很多，胞内无颗粒；肥大细胞形态明显，胞质有细小颗粒；②胶原纤维、弹力纤维示清晰且着色不同显。台盼蓝的注射量、配制浓度和注射时间要适当。浓度低、量少、时间短则巨噬细胞中吞噬颗粒不明显，过多则会造成吞噬颗粒堆积，铺片过程中易破裂，同时肥大细胞和成纤维细胞中也有少量蓝色颗粒，使三种细胞不易区别［5］。

本次实验根据预实验结果采用1%台盼蓝，连续腹腔注射3 d，然后第5天和第7天再注射，共注射5 d，每天1次，这样操作有利于组织间隙中多余染料被巨噬细胞充分吸收，同时也有利于清除掉成纤维细胞胞质内吸入的染料颗粒，从而使组织铺片背景清晰。采用活体取材，即将大白兔麻醉后进行取材，保证在活体状态下取材，避免细胞和组织发生死后变化，能够将细胞完好的保存下来，特别是巨噬细胞和肥大细胞，同时也避免取材时间过长导致材料浪费，能够尽可能保持细胞和组织在活体状态下被取下，制作更多的高质量切片。为了在同一张铺片中同时观察到胶原纤维、弹性纤维、成纤维细胞、巨噬细胞、肥大细胞等多种成分组成的疏松结缔组织，需要采用多色染色法［6，7］。由于此次实验室采用复合染色方法，染色时间的长短与染色后的结果有很大关系，学生在染色时间上掌握的不够准确，加上展片的技术不够熟练，使染色结果呈现多色多样。不过，大多数学生还是能够掌握基本的原理和方法，严格按照实验步骤制作片子，最后成功观察到组织中的细胞和纤维（图1）。但也有一小部分同学，由于不足够细心，染色时间把握不好，或者铺片不到位，有重叠现象，使结果呈现不理想。

在实验课时，很多同学都表现出积极的态度参与到实验中。从一开始饲养动物到给予染色剂注射及实验课时的解剖工作，学生都自愿参与积极配合。通过这次实验教学培养了学生的动手能力、观察能力、思维能力、创新能力，提高了学生学习组织学与胚胎学的兴趣和巩固学生所学的相关基础理论知识，同时，也培养学生的团结协作能力，使学生在短时间内熟练掌握相关理论和操作技能。

3.2开展“疏松结缔组织铺片实验”的意义

疏松结缔组织是重要的基本组织，在人体中分布广泛。“疏松结缔组织铺片的实验制作”是一项综合性实验，此项实验不仅能让学生通过观察结缔组织的多种组成成分（包括细胞和纤维），从而认识和掌握疏松结缔组织的结构特点，而且能把所学理论知识与相关外围知识联系起来，同时拓宽学生的知识面，也能够让学生初步掌握实验动物的基本喂养、解剖、取材方法和疏松结缔组织铺片的制备过程及观察组织切片的方法［8］。在疏松结缔组织铺片的整个制作过程中，要以学生操作为主体，教师给予示范操作后，在一旁适当指导，以使每个学生尽可能发挥潜能，达到培养和锻炼学生的多种能力［9，10］。学生完成实验后可以把自己做好的铺片放在显微镜下观察，这种自己制作自己观察描述的学习方式给学生留下深刻的印象，也会使学生对这部分知识掌握更牢固，取得更好的学习效果；同时，综合性实验的开设活跃了课堂气氛，学生观察能力、动手能力、分析及思维能力的培养及团队合作意识也得到了锻炼，也为其他学科（病理学、微生物免疫学等）的实验技能打下基础［11］。这样也达到了理论与实验一体化教学的目的，使学生把所学的理论知识及时强化、印证，向实践转化；将空洞的授课变得具体，抽象的内容变得形象，感性认识与理性认识高度统一，学生的学习兴趣和能力都得到提高［12］。

“疏松结缔组织铺片的制作”需要用到多方面的基本实验技能，也需要医学生了解和掌握这些基本的实验技能。而且，这项实验也可能是后续的实验或科研中的重要环节，所以教师通过示范关键操作步骤并且在实验过程中随时指导，让学生严格按照实验步骤亲自动手操作，从而培养学生的严谨科研态度，认真练习和掌握基本的实验操作技能。通过这次实验教学的开展，让我们对实验课的教学改革增加信心。我们可以在以后的实验教学当中引入更多的实验操作课程，如血液章节制作“血涂片”实验，呼吸系统实验课“观察纤毛摆动”，生殖系统实验课开展“精子运动”实验课等，给学生更多的机会亲自动手做实验，直接观察实验结果，充分体现学生的主体作用，给学生提供多动手、多动脑、进行创造性思维的机会［12］。通过这次实验教学改革，培养了学生对实验技能的学习和认识，提高了分析问题和解决问题的能力，激发了学生学习组织学与胚胎学的兴趣，并且对巩固学生所学的相关基础理论知识具有重要意义。但是，也让我们得到一个提示：在教学实践过程中存在着一些不足之处，需要不断的改进教学方法，即可以通过成立科研兴趣小组，培养学生的创新能力：让学生参与教研室老师的科研课题，接触并学习一些基本的实验技术，如石蜡切片的制作、HE染色、免疫组化等，开阔学生的视野，培养学生的科研思维；定期开放实验室，并配备相关教师对学生进行辅导和帮助，鼓励学生在业余时间多去实验室，通过观察切片和模型，加深对理论知识的理解和记忆［13，14］，使学生能够很好地将理论学习与基础训练结合起来，激发学生发挥主观能动性，在教学过程中培养学生的独立性和自主性，通过实验或病例分析引导学生质疑、讨论、探究，在学习中主动思考等［15］，只有这样才能够提高组织学实验教学质量，培养医学生综合素质，促进学生的个性发展。

［1］尹洪萍.教学用疏松结缔组织铺片技术的改良［J］.杭州师范学院学报（医学版），2006，10（3）：277-279.

［2］赵佳，姜文华，郝利铭，等．组织学与胚胎学实验教学改革探索［J］.基础医学教育，2014，16（12）：1039-1041.

［3］王新成，李亚鲁，高慧英.疏松结缔组织铺片制作方法的改良和体会［J］.泰山医学院学报，2003，24（2）：192.

［4］陈菁，江澍.疏松结缔组织铺片染色法的经验［J］.解剖科学进展，2001，7（3）：285.

［5］单智焱，孙瑞珍，李秋明，等.组织学与胚胎学教学模式的改革［J］.现代生物医学进展，2010，15（10）：2968-2970.

［6］杨世明.利用醛复红染色法制作家兔皮下疏松结缔组织铺片标本［J］.解剖学报，2014，45（3）：421-423.

［7］王俊梅，平苏宁，汪泓，等.结缔组织铺片脂肪组织油红染色在组织学实验教学中的应用［J］.中国组织化学与细胞化学杂志，2014，23（4）：382-384.

［8］尚宏伟，路欣，张立新，等.医学形态学实验第二课堂活动实践的探索［J］.中国医学装备，2013，10（10）：76-77.

［9］刘同慎.肠系膜疏松结缔组织铺片制作改良法［J］.解剖科学进展，2000，6（3）：286-287.

［10］潘燕，周虹，李卫东，等.医学机能学实验教学的探讨［J］.中国医学装备，2009，6（9）：28-29.

［11］周佳虹，张金萍.开展组织学与胚胎学“看图说话”竞赛，提高学生综合能力［J］.解剖学杂志，2015，38（4）：509-511.

［12］魏静波，刘辉，高俊玲.医学检验专业组织学与胚胎学教学模式改革与实践［J］.解剖学杂志，2013，36（6）：1139-1140.

［13］李徽徽，柴继侠，孙美群.提高组织学与胚胎学实验教学质量的探索［J］.齐齐哈尔医学院学报，2015，36（9）：1365-1366.

［14］柴继侠，齐琦，李徽徽，等.多媒体互动实验室在组织学实验教学改革中的作用［J］.基础医学教育，2011，13 （3）：289-290.

［15］李徽徽，关宿东，卓煜娅．PBL教学法在组织学与胚胎学教学中的应用初探［J］.蚌埠医学院学报，2010，35（1）：79-80.

The application and experience of the stretched preparation method of loose connective tissue in experiment teaching

SONG Junying1，2ZHANG Na2PAN Xiaoli2WANG Qi2WU Yaosong2JIANG Shihong2ZHANG Zhenqiang1，2
1.Laboratory of Medical Immunology，He'nan University of Traditional Chinese Medicine，Zhengzhou 450046，China；2.He'nan University of Traditional Chinese Medicine，Zhengzhou 450046，China

R4

C

1673-9701（2016）15-0130-03

河南省教育科学“十二五”规划重点课题（［2013］-JKGHB-0034）；河南中医学院校级科研课题（2012JX15）；河南中医学院博士科研基金项目（BSJJ2012-07）

2016-03-31）