不同培养温度对变异黄芪内生真菌多样性的影响

曹丹丹 ， 路 浩 ， 薛瑞旭 ， 王 欢 ， 权海云 ， 赵宝玉

(1.西北农林科技大学动物医学院 ， 陕西杨凌712100 ； 2.江苏省泰州市高港区农业委员会 ， 江苏高港225300)

不同培养温度对变异黄芪内生真菌多样性的影响

曹丹丹1,2， 路 浩1， 薛瑞旭1， 王 欢1， 权海云1， 赵宝玉1

(1.西北农林科技大学动物医学院 ， 陕西杨凌712100 ； 2.江苏省泰州市高港区农业委员会 ， 江苏高港225300)

为了探讨温度对变异黄芪内生真菌多样性的影响。对采集于内蒙古腾格里变异黄芪的茎、叶和花，运用表面消毒法和尖端菌丝挑取法将组织块分别置于20 ℃、28 ℃和室温(变温)条件下进行内生真菌分离与纯化，采用形态学和ITS序列分析技术进行种属鉴定，并计算多样性指数。504块组织块中共分离到内生真菌410株，分属于10科15属23种，不同温度下分离到的内生真菌有所不同，Undifilumoxytropis为优势菌属，且在20 ℃时优势更为显著。多样性指数计算结果显示，香农-维纳指数(H)为1.85，辛普森指数(D)为0.269，均匀度指数(E)为0.59，不同温度下多样性指数不同，28 ℃培养香农-维纳指数最高，20 ℃培养辛普森指数最大。结果表明，温度对内生真菌分离率有一定影响，对Undifilumoxytropis分离率的影响极其显著，而对内生真菌的多样性影响也较为明显。

变异黄芪 ； 温度 ； 内生真菌 ； 多样性

变异黄芪(Astragalusvariabilis)俗称碎草、瓜瓜草，是豆科黄芪属(Astragalus)多年生草本植物，全草有毒，广泛分布于我国的内蒙古、甘肃、新疆、青海、宁夏等地的荒漠及半荒漠地区，已成为我国沙漠化草地主要优势植物之一[1-2]。变异黄芪会造成母畜流产、弱胎、胎儿畸形、发育不良，公畜精子品质下降等，严重影响家畜的生长繁殖，给牧民带来巨大经济损失[3-4]。目前，关于变异黄芪的研究主要集中在其中毒病研究及防治[5]、毒性成分分离鉴定及利用[6]、产毒机制[7]、内生真菌的分离鉴定及定量检测[8]等方面。研究表明，培养基、光照对内生真菌的多样性有较大影响[9]，但未见不同温度对变异黄芪内生真菌多样性的影响。本研究以变异黄芪为研究对象，通过分析不同温度下分离出的内生真菌种属差异，探讨不同温度对分离到内生真菌多样性的影响，为进一步深入研究变异黄芪毒素合成机制及与内生真菌互作和抗逆性奠定基础。

1 材料与方法

1.1 样品采集地点 本试验所用变异黄芪于2013年5月采自内蒙古腾格里，采集后立即放入装有变色硅胶的自封袋脱水，避光保存备用。

1.2 培养基 马铃薯葡萄糖琼脂培养基：马铃薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂20 g/L。灭菌后加入双抗抑制细菌生长。

1.3 试剂与仪器 75%乙醇、NaClO、氯仿、异戊醇、CTAB提取液、2×EasyTaqPCR Super Mix、10×Loading Buffer以及DNA Marker(TaKaRa)、引物ITS1和ITS4(南京金斯瑞)、PCR产物回收试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)、电热恒温培养箱、高速冷冻离心机(Sigma 3K15)、全自动凝胶成像系统(Syngene)。

1.4 内生真菌的分离与纯化 将变异黄芪的茎、叶和花用灭菌蒸馏水冲洗干净，无菌滤纸吸干表面水分，75%乙醇漂洗30 s，无菌水冲洗3次，有效氯为2%的NaClO漂洗3 min，无菌水冲洗后，再将组织剪成小块，置于培养基中，于20 ℃、28 ℃和室温下培养，挑取顶端菌丝置于新培养基上，纯化保藏于 4 ℃ 冰箱。

为检查表面消毒是否彻底，做漂洗液检测和组织印记检测，如果两种检测方法培养基上均无任何菌生长，证明表面消毒效果良好，可进行后续试验。

1.5 内生真菌种属鉴定及多样性分析

1.5.1 形态学鉴定 挑取已纯化菌株的尖端菌丝接种于培养基，定期观察其菌落形态、颜色、大小等特征。用无菌盖玻片以45°插入培养基，待菌丝爬片之后，观察其孢子形态、产孢结构等特征，参照真菌鉴定手册对其进行初步鉴定[10]。

1.5.2 rDNA-ITS序列分析鉴定 改良CTAB法提取菌丝DNA，采用真菌rDNA扩增的通用引物ITS 1和ITS 4扩增其5.8S rDNA-ITS保守序列，将目的片段回收纯化测序。

2 结果

2.1 不同温度对分离内生真菌种类及分离率的影响 本试验分离到内生真菌410株，不同温度下茎、叶和花中分离出内生真菌种属见表1，分离率见表1。

表1 不同温度下内生真菌分离种类比较

2.2 不同温度培养对优势内生真菌的影响 由表2可知，不同温度下分离出的内生真菌并不相同，但均分离到U.oxytropis，T.microspore，T.subthermophila，T.basicola，Sordarialessp.和Xylariasp.并且这几种内生真菌的分离率有明显差异(见图1)，尤其是对U.oxytropis，在20 ℃时，其他几种内生真菌的生长被显著抑制，而U.oxytropis的分离率显著提高。

表2 不同温度下内生真菌分离率和物种丰富度指数比较

图1 不同温度下优势内生真菌所占比例

2.3 内生真菌多样性分析比较 香农-维纳指数、辛普森多样性指数和均匀度指数，见表3，与国内甘肃棘豆相比，内蒙古腾格里苏木变异黄芪内生真菌多样性指数整体偏低[9]。

表3 不同温度下变异黄芪内生真菌多样性指数比较

3 讨论

本试验中，室温时内生真菌的分离率最高(表2)，且种类最多(表1)。在20 ℃时，其他内生真菌的生长受到明显抑制，而U.oxytropis的分离率明显提高。这可能是由于其他内生真菌多为快生型，而U.oxytropis为慢生型，在通常条件下，快生型的内生真菌往往抑制慢生型内生真菌的生长，而在温度较低时，快生型内生真菌的生长受到明显抑制，因而提高了慢生型内生真菌的分离率。因此，在选择性分离U.oxytropis时，20 ℃为首选，而在研究内生真菌多样性方面，室温培养较为适宜。

U.oxytropis为本次试验分离到的绝对优势菌属，在3种培养温度下其分离率均较高，在20 ℃时优势尤其明显。本研究还发现，经ITS序列分析鉴定为U.oxytropis的菌株具有不同的形态特征(见图2)，这可能是表观遗传的作用。

图2 U. oxytropis菌落形态

本试验中，整体香农-维纳指数为1.85，辛普森指数为0.269，均匀度指数为0.59。在28 ℃时，香农-维纳指数最高，在20 ℃时，辛普森指数最高。28 ℃和室温下，均匀度指数相似，所以香农-维纳指数也相似，但辛普森指数差别较大可能是由于内生真菌的种类数目差异较大。在20 ℃时，U.oxytropis具有极高的分离率，导致其他内生真菌的分离率明显降低，虽然内生真菌的种类与其他两种温度下无较大差异，但是数量过多集中于U.oxytropis，因而，在20 ℃时，香农-维纳指数、辛普森指数以及均匀度指数都最低。

本研究首次就不同温度对变异黄芪内生真菌多样性的影响进行探讨，可为今后选择性分离U.oxytropis提供一定试验依据，也为进一步阐明我国变异黄芪内生真菌种群分布特征及遗传多样性奠定基础。

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Effect of Different Culturing Temperature on Isolation and Diversity of Fungal Endophyte in Astragalus variabilis

CAO Dan-dan1,2， LU Hao1， XUE Rui-xu1， WANG Huan1， QUAN Hai-yun1， ZHAO Bao-yu1

(1.College of Veterinary Medicine, Northwest A&F University, Yangling 712100, China ; 2.Agriculture Committee of Taizhou high port area, Jiangsu, Gaogang 225300,China)

To ascertain the effect of different temperature on diversity of fungal endophyte fromAstragalusvariabilis, andAstragalusvariabilissamples in Tengeli County of Inner Mongolia were collected.The method of surface disinfection was used to isolate and purify the fungal endophyte in stems, leaves and flowers.And then morphology techniques and ITS sequence analysis were used to identify the species, and the diversity index was calculated.The results showed that 410 fungal endophyte were isolated from 504 samples, which included 23 kinds of fungal endophytes.There were different kinds of fungal endophyte under different temperature, andUndifilumoxytropiswas the dominant strain, especially at 20 ℃.The Shannon-Weiner index was 1.85, Simpson diversity index was 0.269, and evenness index was 0.59.The diversity index was different in different temperature.The Shannon-Weiner index was biggest in 28 ℃, and simpson diversity index was the biggest in 20 ℃.The results show that the influence of temperature to isolation rate of fungal endophyte is not significant, but the isolation rate ofUndifilumoxytropisand diversity of fungal endophyte is significant.

Astragalusvariabilis, Temperature, Endophytic fungi , Diversity

LU Hao

2014-12-17

国家自然科学基金项目(31201958)；国家“十二五”公益性行业(农业)科研专项(201203062)

曹丹丹(1988-)，女，硕士，主要从事疯草内生真菌研究，E-mail:cdd1988228@163.com

路浩，E-mail:luhao@nwsuaf.edu.cn

S859.87

A

0529-6005(2016)12-0041-03