兰术四草化浊解毒方对溃疡性结肠炎大鼠细胞因子水平的影响

李博林 刘启泉 张 晶 闫丹丹 成亚亚 王志坤

(河北省中医院,河北 石家庄 050011)

兰术四草化浊解毒方对溃疡性结肠炎大鼠细胞因子水平的影响

李博林 刘启泉 张 晶1闫丹丹1成亚亚1王志坤

(河北省中医院,河北 石家庄 050011)

目的探讨兰术四草化浊解毒方对溃疡性结肠炎大鼠细胞因子水平的影响。方法 将60只Wistar大鼠随机分为空白组、模型组、阳性药组、兰术四草化浊解毒方大、中、低剂量组，每组10只。除空白组外，其余5组制备溃疡性结肠炎模型。造模后空白组、模型组予蒸馏水灌胃，其余各治疗组给予相应药物灌胃，连续治疗2 w。观察各组大鼠疾病活动指数、结肠黏膜组织病理，血清肿瘤坏死因子(TNF)-α，白细胞介素(IL)-8，IL-10的变化。结果 与模型组比较，兰术四草化浊解毒方能够改善结肠黏膜病理变化，减低疾病活动指数评分，降低血清TNF-α及IL-8的含量，升高血清IL-10的含量(P<0.05)。与阳性药组比较，兰术四草化浊解毒方大剂量组能够降低血清TNF-α及IL-8的含量，升高血清IL-10的含量(P<0.05)；兰术四草化浊解毒方中低剂量组能够降低血清TNF-α及IL-8的含量(P<0.05)，但血清IL-10含量无显著差异(P>0.05)。结论 兰术四草化浊解毒方治疗溃疡性结肠炎的作用机制可能与降低血清TNF-α及IL-8，升高IL-10的含量有关。

兰术四草化浊解毒方；溃疡性结肠炎；肿瘤坏死因子-α；白细胞介素-8；白细胞介素-10

溃疡性结肠炎(UC)其病因和发病机制尚不清楚，可以明确的是在UC的发生发展过程中，免疫因素起了重要作用，而细胞因子则在免疫系统中起着非常重要的调控作用。多种细胞因子及其网络参与了肠道黏膜炎症的形成，其中促炎细胞因子和抗炎细胞因子的失衡在UC的发病过程中起了枢纽作用〔1，2〕。课题组前期发现浊毒相干为害贯穿UC发展的全过程，“浊毒内蕴”是本病的主病机〔3〕。以“浊毒”立论的兰术四草化浊解毒方经临床验证显示出良好疗效，本实验基于平衡细胞因子探讨该方的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 8周龄Wistar 大鼠60只，雄性，清洁级，体重120～140 g，由河北医科大学实验动物中心提供。动物许可证号：SCXK(冀)2008-1-003,合格证编号：1205036。适应性喂养7 d后进入实验。

1.2 实验药物 兰术四草化浊解毒方：佩兰15 g、苍术6 g、炒白术12 g、茯苓20 g、败酱草15 g、旱莲草15 g、豨莶草12 g、仙鹤草20 g、黄连6 g、地榆20 g、佛手12 g、白芍20 g、石榴皮12 g、儿茶6 g 、葛根20 g、当归6 g。药物均购自四川新绿色药业科技发展股份有限公司研发的免煎制剂。上述药物用90℃以上蒸馏水分别配制成中、低剂量人混悬液：5、2.5、1.25 g/ml。柳氮磺吡啶肠溶片，由上海中西三维药业有限公司生产，生产批号：20110619，将片剂用研钵研细，过100目筛，溶于蒸馏水中配制成浓度为0.15 g/ml的柳氮磺吡啶混悬液。

1.3 实验试剂 2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)：由美国Sigma公司生成，批号：2508-19-2。无水乙醇：天津市永大化学试剂有限公司生产。肿瘤坏死因子(TNF)-α放射免疫分析试剂盒：由北京华埠力特生物技术研究所生产。白细胞介素(IL)-8放射免疫分析试剂盒：由北京普尔伟业生物科技有限公司生产。IL-10定量酶联检测试剂盒：由上海森雄科技实业有限公司生产。

1.4 实验方法

1.4.1 动物分组 正常适应性饲养7 d后，将60只大鼠按照随机数字表法分为6组，每组10只，分别为空白组(N组)、 模型组(M组)、阳性药组(SASP组)、 兰术四草化浊解毒方大剂量组(HD组)、兰术四草化浊解毒方中剂量组(MD组)兰术四草化浊解毒方低剂量组(LD组)。

1.4.2 模型制备 采用TNBS/乙醇法诱导UC模型〔3〕。将5%TNBS与50%乙醇以体积1∶1配制成TNBS/乙醇混合液作为造模剂。操作方法:除N组外，其他各组大鼠禁食不禁水24 h后称体质量，乙醚麻醉，按照4 ml/kg(相当于TNBS100 mg/kg)剂量将造模剂用直径2 mm的一次性橡胶输液软管推入距肛门约8 cm处的肠腔内，提起大鼠尾部，倒置30 s使造模剂充分深入大鼠肠腔，再捏紧大鼠肛门平放10 min左右。造模后大鼠归笼，常规饲养，自由饮食。3 d后，随机抽取2只M组大鼠处死，取其结肠标本，病理检查确认有充血、水肿及典型溃疡形成等一系列病理变化即为造模成功。造模时HD组、LD组各死亡1只。

1.4.3 给药途径和方法 N组、M组予蒸馏水2 ml/kg灌胃；HD组予20 g/kg予大剂量混悬液灌胃；MD组予10 g/kg混悬液灌胃；LD组按予5 g/kg混悬液灌胃；SPAP组予SPAP混悬液,按0.3 g/kg灌胃(相当于成人用药量的10倍)。各组给药1次/d,各组连续灌胃14 d。

1.4.4 标本的采集和处理 治疗2 w后，停止给药将大鼠禁食不禁水24 h后，断头处死取血，每只取血4 ml，注入试管中待凝固后，4℃ 3 000 r/min离心10 min，分离血浆、血清，置-20℃低温冰箱保存待检测。开腹，在距肛门8 cm处取病变部位最明显处取2 cm标本，放入10%中性甲醛固定24 h后常规脱水、石蜡包埋、HE染色。

1.4.5 观测指标与检测方法

1.4.5.1 疾病活动指数(DAI)评分 DAI评分参照文献〔7〕的标准。

1.4.5.2 结肠黏膜大体观察及组织病理学观察 治疗结束后，处死大鼠，解剖过程中取大鼠全结肠，生理盐水冲洗干净后肉眼观测结肠黏膜的色泽、充血水肿、糜烂、溃疡、出血点情况；显微镜下观察结肠组织的病理变化，包括炎性细胞浸润，腺体结构，黏膜下血管及溃疡等情况。

1.4.5.3 血清TNF-α、IL-8、IL-10指标检测 TNF-α、IL-8含量测定：采用放射免疫法检测。血清IL-10含量测定：采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测，具体方法和操作步骤严格按试剂盒说明书进行。

1.5 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件进行单因素方差分析，SNK-q检验。

2 结 果

2.1 各组大鼠结肠黏膜大体观与组织病理学观察 肉眼观察大鼠结肠黏膜M组最差；HD组黏膜表面光滑，可见少量浆液渗出，皱襞整齐，恢复接近N组；MD组黏膜欠光滑，皱襞比较整齐，可见少许点状出血区。SASP组和LD组结肠黏膜状况介于MD组和M组之间,两组无明显区别。

在组织病理学方面:N组大鼠结肠黏膜上皮完整，黏膜下血管丰富清晰，腺体排列规则，结构清楚，未见到充血水肿、溃疡、糜烂点。M组大鼠镜下溃疡数量最多，溃疡面大，组织充血水肿明显，大部分黏膜缺损，有大量的炎性细胞浸润，腺体破坏。SASP和LD组仍可见到溃疡，组织充血水肿较明显，有较多炎性细胞浸润。MD组溃疡较少，溃疡较浅表，可见部分已愈合的溃疡组织，轻度组织充血水肿，少量炎性细胞浸润。HD组溃疡较少，可见已愈合的溃疡组织，组织充血水肿不明显，其基本形态与N组相似。

2.2 各组大鼠DAI评分及血清TNF-α比较 其他各组(除HD组)大鼠血清TNF-α含量均明显升高，各组DAI评分升高(均P<0.05)。与M组比较，各治疗组大鼠血清TNF-α含量及DAI评分均明显降低(P<0.05)。HD组与MD组、LD组、SASP组比较，能明显降低大鼠血清TNF-α含量及DAI评分(P<0.05)；与SASP组比较，LD组在降低大鼠血清TNF-α含量及DAI评分上，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

组别nDAITNF⁃α(ng/ml)N组100 00±0 003)0 55±0 113)M组82 50±0 311)1 30±0 121)SASP组101 57±0 391)2)3)1 14±0 131)2)3)HD组90 37±0 351)2)0 65±0 112)MD组100 80±0 281)2)3)0 82±0 101)2)3)LD组91 44±0 331)2)3)1 02±0 201)2)3)

与N组比较:1)P<0.05；与M组比较:2)P<0.05；与HD组比较:3)P<0.05；下表同

2.3 各组血清IL-8、IL-10比较 与N组比较，其他各组大鼠血清IL-8含量明显升高，IL-10含量明显降低(P<0.05)；与M组比较，各治疗组大鼠血清IL-8含量明显降低，IL-10含量均明显升高(P<0.05)；HD组与MD组、LD组、SASP组比较，能明显降低大鼠血清IL-8含量，升高大鼠血清IL-10含量(P<0.05)；与SASP组比较，LD组血清IL-8含量的降低与IL-10含量的升高(P>0.05)。见表2。

组别nIL⁃8(ng/ml)IL⁃10(pg/ml)N组100 17±0 032)28 02±2 022)M组80 45±0 061)12 80±2 571)SASP组100 39±0 041)2)3)20 81±3 281)2)3)HD组90 27±0 061)2)24 69±4 051)2)MD组100 33±0 051)2)3)19 05±4 691)2)3)LD组90 38±0 071)2)3)17 26±2 001)2)3)

3 讨 论

在UC的发病过程中，细胞因子失衡导致免疫失调，是本病发生的关键枢纽环节〔4〕。TNF-α是一个多效的炎症性细胞因子，对肠道上皮细胞增殖和凋亡有重要的调节作用，参与感染、炎症和自身免疫调节。因TNF-α在T细胞依赖的肠道炎症中起着重要的促进作用，而成为细胞因子网路中的关键因子或祸首因子，并且TNF-α是UC发病的主要炎性启动因子〔5,6〕。IL-8是多核白细胞移动因子，是一种重要的介导淋巴细胞功能的效应介质，其作用主要是趋化和激活嗜中性粒细胞〔7〕，对中性粒细胞、T细胞、嗜碱性粒细胞均有趋化作用〔8〕。目前认为TNF-α、IL-1、IL-6诱发的炎症反应很大程度上是通过IL-8为代表的趋化因子所介导的〔9，10〕。IL-10作用主要是抑制致炎因子的释放和炎症反应、调节多种免疫细胞的增殖分化〔11〕，是目前公认的抑炎因子。IL-10抗炎活性的关键所在是对TNF和IL-1产生的抑制效应，能够明显抑制TNF-α的分泌，并且可抑制肥大细胞激活，从而参与变态反应的调节，在维持正常肠道黏膜免疫系统调节中发挥重要作用〔12〕。

以上论述可见UC是以TNF-α为主的炎性因子启动了病变的过程并参与炎症细胞相互作用，加重局部肠黏膜炎症反应；同时刺激相关细胞分泌IL-8，升高的IL-8通过趋化作用，导致组织细胞浸润，加重肠黏膜炎性损伤，而IL-10则通过抑制炎症相关因子如TNF-α、IL-8等减轻炎症反应，降低组织损伤。

溃疡性结肠炎是西医病名，依据其临床表现，中医将其归属于“久痢”、“滞下”、“肠澼”、“肠风”等范畴。笔者认为“浊毒内蕴”是本病的主病机，浊毒相干为害贯穿于UC发展的全过程。本病病位在大肠，与脾胃关系密切，初病多实，久病多虚或虚实夹杂。病机为脾胃失和，运化失职，水湿内停，阻滞气机，郁而化浊，久而成毒，浊毒久伏，蕴结肠腑，损伤脂膜血络，则成脓血。病理上呈现痰、浊、瘀、毒互结为害。佩兰、白术、茯苓、苍术健脾助运而化湿祛浊，其中佩兰、苍术芳香化浊，助白术、茯苓化湿健脾；白术、茯苓益气健脾化湿，助佩兰、苍术运湿化浊。黄连、败酱草清热解毒。佛手行气导滞。仙鹤草、旱莲草、白芍补虚敛肠。地榆、儿茶、当归活血祛瘀而止泻疗疮。石榴皮、葛根清肠止泻。白芍、当归养血和血，柔肝止痛，配旱莲草兼补肝肾。诸药相合，脾胃健运，水湿得化；肝脾和调，气机畅利；气血和畅，痰瘀得消，毒邪得解，而浊毒自愈。

兰术四草化浊解毒方能够降低模型大鼠血清TNF-α、IL-8等促炎因子同时提高IL-10等抗炎因子，以达到平衡细胞因子而起到抗炎和调节免疫作用。

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〔2015-07-29修回〕

(编辑 苑云杰/曹梦园)

国家中医药管理局全国名老中医药专家传承工作室建设项目(国中医药人教发(2014)20号)；河北省政府重大项目(2014571034)

王志坤(1974-)，女，硕士，主任医师，教授，主要从事中医内科学研究。

李博林(1986-)，男，博士，主治医师，主要从事中医内科学研究。

R256.3

A

1005-9202(2016)24-6085-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.24.018

1 河北医科大学