大黄素对脂多糖诱导单核细胞分泌白细胞介素-1β、白细胞介素-6及肿瘤坏死因子-α的抑制作用

2016-02-06黄玉珊

中国老年学杂志 2016年24期

关键词：牙周组织介素内毒素

李升黄玉珊秦翠

(井冈山大学医学院，江西吉安 343009)

大黄素对脂多糖诱导单核细胞分泌白细胞介素-1β、白细胞介素-6及肿瘤坏死因子-α的抑制作用

李升黄玉珊秦翠1

(井冈山大学医学院，江西吉安 343009)

目的研究大黄素对内毒素诱导单核细胞分泌白细胞介素(IL)-1β、IL-6和肿瘤坏死因子(TNF)-α的抑制作用。方法采用人外周血分离培养单核细胞，25 μg/ml内毒素作为刺激因子，观察0.1，0.5，1，5，10，25 μg/ml 6种质量浓度的大黄素对单核细胞分泌IL-1β、IL-6和TNF-α活性的影响，以酶联免疫吸附法(ELISA)测定IL-1β、IL-6和TNF-α的水平。结果大黄素对内毒素诱导单核细胞分泌IL-1β和TNF-α均有一定影响，大黄素浓度在0.5～10 μg/ml可显著抑制LPS诱导单核细胞分泌IL-1β，并在1 μg/ml时达到最大抑制作用；大黄素在较低浓度时(0.1，0.5 μg/ml)对单核细胞分泌TNF-α具有显著抑制作用，但当浓度升高时，抑制作用减弱。大黄素对内毒素诱导单核细胞分泌IL-6没有明显影响。结论大黄素在一定浓度范围内对内毒素诱导单核细胞分泌IL-1β及TNF-α均有显著抑制作用，这可能是大黄素治疗牙周炎的机制之一。

大黄素；牙周炎；内毒素；白细胞介素(IL)；肿瘤坏死因子(TNF)-α；单核细胞

大黄素作为中药大黄的有效成分，动物实验已经证实大黄素能阻断细菌脂多糖(LPS)对牙周组织的损害〔1〕，但具体作用机制尚未明确。而在牙周病的发病机制当中，LPS除直接对靶细胞的毒性作用外，还能刺激单核细胞诱生白细胞介素(IL)-1β、IL-6和肿瘤坏死因子(TNF)-α等细胞因子，对炎症反应起重要作用，与牙周病变的发生和发展密切相关。因此，本文探讨大黄素对LPS诱导单核细胞分泌IL-1β、IL-6和TNF-α的抑制作用。

1 材料和方法

1.1 主要试剂与仪器大黄素标准品(中国药品生物制品检定所)；100 ml新鲜抗凝全血(南京市血液中心)；淋巴细胞分离液(天津灏洋生物制品科技有限责任公司)；Hanks液及RPMI1640培养液(Gibco公司)；胎牛血清(FuMeng Gene公司)；LPS(南京大学生物医药技术国家重点实验室惠赠)；人IL-1β、IL-6及TNF-α ELISA试剂盒(晶美生物)。洗板机(BIO-RAD公司，1575型)；酶标仪(BIO-TEK公司，ELX800型)。

1.2 单核细胞的分离培养〔2〕取新鲜抗凝全血100 ml，用Hanks液按1∶1体积比稀释后，以人淋巴细胞分离液按说明书操作进行梯度密度离心分离，悬于含10%胎牛血清及双抗(青、链霉素各100 U/ml)的RPMI1640培养液中，使用细胞计数板调整细胞密度至2×106/ml。将上述细胞悬液接种到培养瓶中，培养3 h，镜检确定细胞贴壁后，轻轻换去培养液，继续培养24 h，换液后即得单核细胞用于实验，台盼蓝染色确定细胞活力>95%。

1.3 药物干预将上述贴壁细胞用细胞刷处理，悬于RPMI1640培养液，接种于24孔培养板中，每孔1 ml细胞，每组4个复孔。继续培养24 h贴壁后，弃原培养液，清洗2次后加药。分组如下：空白对照组(不加任何药物)，LPS组，LPS+大黄素组(大黄素终浓度分别为：0.1、0.5、1、5、10、25 μg/ml)，LPS+地塞米松组(地塞米松终浓度为2 μg/ml)，所有组中LPS终浓度均为25 μg/ml。

1.4 细胞因子浓度测定培养48 h后，吸取培养液上清，根据试剂盒说明采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定各细胞因子浓度。

1.5 统计学方法采用SPSS12.0软件进行t检验。

2 结果

2.1 各组IL-1β浓度当大黄素的浓度达到0.5 μg/ml时，可以显著抑制LPS诱导单核细胞分泌IL-1β，其抑制作用在浓度为1 μg/ml时达到最大效应(54.5%)，当浓度超过1 μg/ml时抑制作用逐渐减弱，达到25 μg/ml时，抑制作用与空白对照组无显著差异(P>0.05)，见表1。

2.2 各组IL-6浓度比较大黄素对IL-6的分泌没有明显抑制作用，各组的IL-6浓度与LPS组相比均无显著差异(P>0.05)，见表1。

2.3 各组TNF-α浓度大黄素在较低浓度时(0.1、0.5 μg/ml)时对LPS诱导单核细胞分泌TNF-α具有显著抑制作用(P<0.05)，当大黄素浓度升高时抑制作用减弱(P>0.05)，见表1。

组别IL⁃1β(ng/ml)IL⁃1β抑制作用(%)IL⁃6(ng/ml)TNF⁃α(ng/ml)TNF⁃α抑制作用(%)空白对照组1 07±0 31-1 31±0 441 31±0 44-LPS组1 98±0 0401 72±0 222 70±0 400LPS+0 1μg/ml大黄素组1 74±0 3012 11 67±0 181 16±0 181)57 0LPS+0 5μg/ml大黄素组1 39±0 051)29 81 65±0 341 10±0 211)59 3LPS+1μg/ml大黄素组0 90±0 081)54 51 73±0 251 67±0 2038 1LPS+5μg/ml大黄素组1 43±0 021)27 81 69±0 372 10±0 4722 2LPS+10μg/ml大黄素组1 81±0 061)8 61 82±0 412 52±0 446 7LPS+25μg/ml大黄素组1 92±0 043 01 74±0 382 49±0 417 8LPS+2μg/ml地塞米松组0 53±0 3273 20 91±0 220 51±0 1181 1

与LPS组比较：1)P<0.05

3 讨论

大黄素是中药大黄的有效成分之一，目前的研究认为大黄具有一系列的药理作用，包括抗厌氧菌作用；免疫调节作用；清除氧自由基；对细胞的保护作用等〔3〕，对其在牙周病防治中的作用目前提出的主要观点有：大黄素能阻断内毒素对人牙周膜细胞的毒性作用〔4〕；大黄素可抑制牙周附着丧失和牙槽骨吸收，并能促进牙槽骨形成〔5〕；能阻断LPS对动物牙周组织的损害〔1〕。细菌作为牙周炎的始动因子，其LPS是重要的致病因素，其激发的宿主反应是造成牙周组织破坏的主要原因。LPS是诱导产生IL-1β、IL-6和TNF-α的强刺激剂，而IL-1β是炎症反应的重要介质，IL-1β能直接趋化激活中性粒细胞、粒细胞及肥大细胞等在牙周组织的聚集和浸润，并释放前列腺素、白三烯B4等多种酶和炎症介质，参与牙周炎的形成，也可通过介导牙周组织中的非炎症细胞如成纤维细胞、破骨细胞的功能活动，使其合成和分泌一系列酶及前列腺素等，引起基质降解、结缔组织丧失和骨破坏。IL-6能活化破骨细胞，促进骨吸收，参与局部炎症反应和牙周组织破坏。TNF-α是一种强烈的骨吸收因子，能通过增加破骨细胞数量、减少骨基质钙化而引起骨吸收。因此，有学者〔6〕提出，IL-1β、IL-6和TNF-α作为炎症和骨吸收介质，在牙周炎的发生发展中起一定作用，有可能成为牙周炎诊断的分子标志物。本研究结果发现大黄素在一定浓度范围内对LPS诱导单核细胞分泌IL-1β及TNF-α均有显著抑制作用，这可能是大黄素治疗牙周炎的机制之一，其中具体抑制作用机制，还有待进一步研究。

1 杨明华,张东生,陈湘华,等.大黄素抑制脂多糖诱导动物性牙周炎的组织学研究〔J〕.江苏医药杂志,2002；28(9):659-61.

2 薛庆善.体外培养的原理与技术〔M〕.北京:科学技术出版社,2001：590-3.

3 杨明华,俞未一.中药大黄在牙周病防治中的应用前景〔J〕.口腔医学研究,2005；21(1):101-2.

4 杨明华,俞未一.大黄抑制内毒素对牙周膜细胞作用的研究〔J〕.临床口腔医学杂志,2004；20(3):148-50.

5 刘冰,李淑娟,杨冬茹,等.大黄素治疗实验性牙周炎的骨计量学研究〔J〕.实用口腔医学杂志,2010；26(5):593-6.

6 耿卫艳,谭颖徽,施生根,等.重度牙周炎病人非刺激性全唾液中IL-6和TNF-α检测〔J〕.牙体牙髓牙周病学杂志,2009；19(5):268-70.

〔2015-04-22修回〕

(编辑冯超/曹梦园)

吉安市指导性科技计划项目(吉市科计字〔2014〕4号)

李升(1983-)，男，硕士，讲师，主要从事循证口腔医学研究。

R781

1005-9202(2016)24-6069-02；