持续被动运动对兔骨关节炎软骨细胞凋亡相关基因P53、caspase-3、Bcl-2和Bax的影响

黄吉利 罗 明 潘 捷 赵鸿声

(江汉大学附属医院骨科，湖北 武汉 430015)

持续被动运动对兔骨关节炎软骨细胞凋亡相关基因P53、caspase-3、Bcl-2和Bax的影响

黄吉利 罗 明1潘 捷 赵鸿声

(江汉大学附属医院骨科，湖北 武汉 430015)

目的观察持续被动运动(CPM)对兔骨关节炎(OA)软骨细胞凋亡及凋亡相关基因P53、caspase-3、Bcl-2、Bax表达的影响。方法 36只新西兰大白兔随机分为对照组、模型组、治疗组，每组12只。C组兔子在术后第1天即开始进行CPM治疗，8 h/d，连续8 w。流式细胞术检测关节软骨细胞凋亡情况。RT-PCR和Western印迹方法检测关节软骨细胞凋亡相关基因P53、caspase-3、Bcl-2、Bax表达情况。结果 与对照组软骨细胞凋亡率(8.08±1.23)%相比，模型组软骨细胞凋亡率(39.85±9.93)%显著升高(P<0.01)；凋亡相关基因P53、caspase-3、Bax表达出现显著上调，Bcl-2表达出现显著下调。给予CPM治疗后，与模型组相比，治疗组软骨细胞凋亡率显著降低(P<0.01)，凋亡相关基因P53、caspase-3、Bax表达出现显著下调，Bcl-2显著上调。结论 CPM可通过影响兔OA膝关节软骨细胞的凋亡情况，从而改善OA病情，其机制可能与调节凋亡相关基因P53、caspase-3、Bcl-2、Bax表达相关，为临床上利用CPM治疗OA提供了一定的科学依据。

持续被动运动；骨关节炎；软骨细胞；凋亡

骨关节炎(OA)是一种与年龄相关的退行性疾病，临床表现为缓慢发展的关节疼痛、压痛、僵硬、关节肿胀、活动受限和关节畸形等〔1～3〕。OA病理特征是软骨细胞功能丧失和细胞外基质(ECM)降解。软骨细胞凋亡改变了软骨基质的合成，从而导致基质退化和破坏，最终导致OA发病。预防软骨细胞凋亡已成为目前临床治疗OA的潜在靶标之一〔4，5〕。已知持续被动运动(CPM)在OA治疗中具有显著的疗效。然而，CPM治疗OA的机制目前还不是很清楚。本研究拟观察CPM对兔软骨细胞凋亡相关基因P53、caspase-3、Bcl-2、Bax表达的影响，深入研究CPM治疗OA的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 健康雄性新西兰大白兔36只，购自重庆医科大学实验动物中心〔许可证：SYXK(渝)20070001；动物合格证号：SCXK(渝)20020001〕，体重2.0～2.5 kg，随机分为对照组、模型组、治疗组，每组12只，对照组兔子仅手术切开关节囊而不损伤关节软骨，术后笼内自由活动；模型组和治疗组采用Hulth方法进行造模〔6〕，模型组兔子术后笼内活动；治疗组兔子在术后第1天即开始进行CPM，8 h/d，连续8 w。8 w后处死所有兔子。

1.2 软骨细胞获取方法 无菌条件下分离兔软骨组织，并采用眼科剪剪碎至1～3 mm，用Hank液清洗2次，随后加入0.25%Ⅱ型胶原酶在37℃消化1 h，采用100目孔径滤网过滤，收集滤过液，1 500 r/min离心5 min，所得沉淀即为兔软骨细胞。

1.3 凋亡染色方法 获取的软骨细胞以RPMI1640重悬并计数。采用Annexin V/7-AAD方法检测细胞凋亡情况。具体操作方法参见试剂盒说明书。

1.4 RT-PCR Trizol提取细胞总RNA，反转录成cDNA。PCR反应条件：95℃ 5 min，95℃10 s，60℃ 20 s，共40个循环。得到的数据通过比较CT值法(2-△△Ct)进行定量分析。见表1。

1.5 Western印迹方法 采用Novagen公司的Cytobuster提取细胞总蛋白，提取蛋白经10% SDS-PAGE 分离胶和5%浓缩胶分离后，通过湿转的方法将蛋白转印至硝酸纤维素膜上，硝酸纤维素膜以含5%脱脂奶粉的TBST室温封闭2 h，加入相应一抗4℃旋转孵育过夜。次日采用0.1% TBST 洗膜3次，每次5 min，加入山羊抗兔/鼠IgG的HRP标记二抗，室温旋转孵育1 h。0.1% TBST 洗膜3次，每次5 min。硝酸纤维素膜以Supersignal West Femto化学发光底物对条带进行显色。β-actin作为内参对照。所有实验至少重复3次。

1.6 统计学方法 采用Graphpad软件行t检验。

表1 RT-PCR检测基因及引物序列表

基因序列P53正向：5′⁃GGAGACATTTTCAGGCTTATGG⁃3′反向：5′⁃AGAAGGGACAAAAGATGACAGG⁃3′caspase⁃3正向：5′⁃GCACTGGAATGTCAGCTCGCA⁃3′反向：5′⁃GCCACCTTCCGGTTAACACGA⁃3′Bcl⁃2正向：5′⁃GGCATGTGCACAGCTGGAT⁃3′反向：5′⁃AGAGAGCCAGCAGAAATCAAACA⁃3′Bax正向：5′⁃TGCCAGCTGACAAGTATGCT⁃3′反向：5′⁃TATAGTGCACACGGCCTTGAG⁃3′U6正向：5′⁃GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT⁃3′反向：5′⁃CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT⁃3′

2 结 果

2.1 软骨细胞凋亡检测结果 对照组软骨细胞凋亡率为(8.08±1.23)%，模型组为(30.19±7.21)%，治疗组软骨细胞凋亡率为(11.14±4.03)%，与模型组相比，治疗组软骨细胞凋亡率显著降低(P<0.01)。

2.2 凋亡相关基因mRNA表达水平检测结果 与对照组(2.56±0.62，2.15±0.46，1.85±0.06，14.56±2.23)相比，模型组软骨细胞凋亡相关基因P53(8.13±1.14)、caspase-3(17.5±3.23)、Bax mRNA(4.72±0.60)表达水平显著上调，Bcl-2 mRNA(1.04±0.86)表达水平显著下调。给予CPM治疗后，与模型组相比，治疗组软骨细胞凋亡相关基因P53(2.67±0.43)、caspase-3(4.17±0.41)、Bax mRNA(2.49±0.08)表达水平出现显著下调，Bcl-2 mRNA表达水平(12.42±2.14)出现显著上调。见图1。

图1 RT-PCR方法检测凋亡相关基因表达情况

2.3 凋亡相关基因蛋白表达水平检测结果 与对照组相比，模型组软骨细胞凋亡相关基因P53、caspase-3、Bax的蛋白表达水平显著上调，Bcl-2的蛋白表达水平显著下调。给予CPM治疗后，与模型组相比，治疗组软骨细胞凋亡相关基因P53、caspase-3、Bax的蛋白表达水平显著下调，Bcl-2的蛋白表达水平显著上调。见图2。

图2 Western印迹方法检测凋亡相关基因表达情况

3 讨 论

CPM在全膝关节置换术恢复治疗中疗效显著，在OA治疗中也取得一定的成果〔7〕。然而关于CPM治疗OA，改善OA病情的机制目前尚未完全研究清楚。软骨细胞凋亡所致的软骨退变在OA发生发展中起重要作用〔8,9〕。那么CPM是否可通过改善软骨细胞的凋亡情况从而改善OA病情目前还未见文献报道。据此，本研究首先观察了在CPM治疗后软骨细胞的凋亡情况，结果显示，在OA模型组软骨细胞的凋亡情况显著升高，该结果与文献报道的软骨细胞凋亡是OA发病的主要原因相一致〔8,9〕。在给予CPM治疗后，软骨细胞的凋亡水平显著降低。上述结果提示，CPM可通过改善软骨细胞的凋亡情况，进而改善OA病情。

细胞凋亡是由多个信号通路调控的一个程序性细胞死亡过程。P53基因介导的细胞信号转导途径在调节细胞正常生命活动中起重要作用，与细胞凋亡密切相关〔10〕。caspase蛋白酶是引起细胞凋亡的关键酶，其中，caspase-3被认为是各种凋亡刺激因子激活的caspase家族中的关键蛋白酶，一旦caspase-3被激活，能将细胞内的蛋白质降解，使细胞不可逆地走向死亡〔11〕。B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)基因是一种原癌基因，已知与内在凋亡途径密切相关〔12〕。Bax基因主要通过与Bcl-2形成同源或异源二聚体形式发挥作用，当Bax同源二聚体形成时，便诱导细胞凋亡。本研究结果显示，与对照组相比，模型组软骨细胞凋亡相关基因P53、caspase-3、Bax的表达水平显著上调、Bcl-2的表达水平出现显著下调，该结果与模型组软骨细胞凋亡水平显著升高相一致。而给予CPM治疗后，与模型组相比，治疗组软骨细胞凋亡相关基因P53、caspase-3、Bax表达水平出现显著下调，Bcl-2的表达水平出现显著上调。

综上所述，本研究结果证实CPM改善兔OA病情的机制可能是改善软骨细胞凋亡水平。CPM调节软骨细胞凋亡机制可能与调节凋亡相关基因P53、caspase-3、Bcl-2、Bax表达相关。

1 García-Padilla S，Duarte-Vázquez MA，Gonzalez-Romero KE，etal.Effectiveness of intra-articular injections of sodium bicarbonate and calcium gluconate in the treatment of osteoarthritis of the knee：a randomized double-blind clinical trial〔J〕.BMC Musculoskelet Disord，2015；16(1)：114.

2 Osajie FE，Yakubu K.A retrospective non-comparative analysis of the quality of care for osteoarthritis at the general out-patient department of Jos University Teaching Hospital，Nigeria〔J〕.J Family Med Prim Care，2015；4(2)：217-20.

3 Tsolis KC，Bei ES，Papathanasiou I，etal.Comparative proteomic analysis of hypertrophic chondrocytes in osteoarthritis〔J〕.Clin Proteomics，2015；12(1)：12.

4 Xu Y，Dai GJ，Liu Q，etal.Sanmiao formula inhibits chondrocyte apoptosis and cartilage matrix degradation in a rat model of osteoarthritis〔J〕.Exp Ther Med，2014；8(4)：1065-74.

5 Thomas CM，Fuller CJ，Whittles CE，etal.Chondrocyte death by apoptosis is associated with the initiation and severity of articular cartilage degradation〔J〕.Int J Rheum Dis，2011；14(2)：191-8.

6 Xie GP，Jiang N，Wang SN，etal.Eucommia ulmoides Oliv.bark aqueous extract inhibits osteoarthritis in a rat model of osteoarthritis〔J〕.J Ethnopharmacol，2015；162：148-54.

7 Kitay GS，Koren MJ，Helfet DL，etal.Efficacy of combined local mechanical vibrations，continuous passive motion and thermotherapy in the management of osteoarthritis of the knee〔J〕.Osteoarthritis Cartilage，2009；17(10)：1269-74.

8 Chen Q，Zhang B，Yi T，etal.Increased apoptosis in human knee osteoarthritis cartilage related to the expression of protein kinase B and protein kinase Ca in chondrocytes〔J〕.Folia Histochem Cytobiol，2012；50(1)：137-43.

9 Huang JG，Xia C，Zheng XP，etal.17β-Estradiol promotes cell proliferation in rat osteoarthritis model chondrocytes via PI3K/AKT pathway〔J〕.Cell Mol Biol Lett，2011；16(4)：564-75.

10 Tian X，Zeng G，Li X，etal.Cantharidin inhibits cell proliferation and promotes apoptosis in tongue squamous cell carcinoma through suppression of miR-214 and regulation of p53 and Bcl-2/Bax〔J〕.Oncol Rep，2015；33(6)：3061-8.

11 Na KS，Park BC，Jang M，etal.Protein disulfide isomerase is cleaved by caspase-3 and-7 during apoptosis〔J〕.Mol Cells，2007；24(2)：261-7.

12 Thomas HE，McKenzie MD，Angstetra E，etal.Beta cell apoptosis in diabetes〔J〕.Apoptosis，2009；14(12)：1389-404.

〔2015-12-18修回〕

(编辑 徐 杰)

黄吉利(1979-)，男，硕士，主治医师，主要从事骨与关节损伤研究。

R68

A

1005-9202(2016)24-6067-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.24.009

1 湖北医药学院附属太和医院急诊外科