猪圆环病毒2型吉林株的分离鉴定及全基因序列分析

王东源，王玉舜，谷 禹，金天明，高 丰

（1. 吉林大学 动物医学学院，长春 130062；2. 北辰区养殖业发展服务中心，天津 300400；3. 天津农学院 动物科学与动物医学学院，天津 300384）

猪圆环病毒2型吉林株的分离鉴定及全基因序列分析

王东源1,2，王玉舜2，谷 禹2，金天明3，高 丰1,通信作者

（1. 吉林大学 动物医学学院，长春 130062；2. 北辰区养殖业发展服务中心，天津 300400；3. 天津农学院 动物科学与动物医学学院，天津 300384）

利用大体病理剖检、病理组织学观察、病原分离、PCR检测等方法对长春郊区一例猪圆环病毒病进行了病理学和病原学诊断，证实造成病猪死亡的原因为猪圆环病毒2型（porcine circovirus 2, PCV2）感染所致，并将该分离毒株命名为PCV2-JL/China/2015。参照Genbank已公布的PCV2基因序列，设计合成一对用于PCV2全基因序列扩增的特异性引物，成功获得PCV2-JL/China/2015毒株的全基因序列。序列测定结果显示，PCV2-JL/China/2015毒株基因组全长为1 767 bp；遗传进化树分析结果显示，该分离株与我国湖南长沙病毒株FJ594471-1C01分离株亲缘关系较近，处于同一进化分支上。

猪圆环病毒2型；分离鉴定；全基因序列

猪圆环病毒病（porcine circovirus diseases, PCVD）是由猪圆环病毒2型（porcine circovirus 2，PCV2）引起的一种新型的传染病，PCV2在分类上属于圆环病毒科，圆环病毒属成员，是一种无囊膜、小的、共价闭合的单股环状负链DNA病毒，主要侵害8～12周龄的仔猪，临床感染猪主要表现为消瘦，皮肤苍白，呼吸障碍，偶尔伴发有腹泻和黄疸[1-2]。PCV2具有免疫抑制性，主要损害猪的免疫系统，进而引发继发感染，或者与其他病毒一起引发混合感染，由此给养猪业造成难以估算的经济损失。目前，该病已被我国农业部规定为二类动物疫病。

2014年12月，吉林省长春郊区一养猪户饲养猪群发生疑似猪圆环病毒病疫情，其新购的90头断奶仔猪中先后有10多头陆续发病，发病仔猪初期出现食欲不振、呼吸困难、体温轻微升高，不爱运动，常呈趴卧姿势。后期病猪表现为消瘦、腹泻、全身皮肤苍白，部分病猪在后肢和会阴部皮肤可见有暗红色不规则的斑点/块状丘疹，最后病猪出现全身多系统衰竭而死亡。本研究利用大体病理剖检、病理组织学观察、病原分离、PCR检测等方法从病原学和病理学角度对该起病例的发生原因进行综合分析，证实为猪圆环病毒2型感染所致。利用猪肾传代细胞（PK-15细胞）从脾脏、淋巴结等病料组织中成功分离获得1株病毒，并将该分离毒株命名为PCV2- JL/China/ 2015。为了进一步明确该分离株的分子特性，利用PCR扩增获得PCV2-JL/China/ 2015的全基因组序列，并在此基础上进行遗传进化树分析。结果显示，该分离株与我国湖南长沙病毒株FJ594471-1C01分离株亲缘关系较近，处于同一进化分支上。本研究结果不仅为PCVD的临床诊断、病理学研究提供依据，而且可为进一步开展PCV2致病机制、疫苗等研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

样品采集自长春郊区养猪户送检疑似猪圆环病毒病病死仔猪，PK-15细胞由本实验室保存；MiniBEST病毒DNA提取试剂盒、rTaqDNA聚合酶、dNTP Mixture、琼脂糖、DNA MarkerDL 2000、pMD-18T载体等购自大连Takara公司；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒为Axygen公司产品；DMEM粉剂、胎牛血清、胰蛋白酶为GIBCO公司产品；青霉素、链霉素等购自上海生物工程有限公司；多聚甲醛、苏木素染液、伊红染液、无水乙醇、石蜡（熔点分别为54 ℃和56 ℃）、二甲苯、NaCl、KCl等均为国产分析纯试剂。

1.2 病理剖检及样本采集

按照常规的病理剖检技术对临床送检病死仔猪进行尸检，并详细记录各个器官的病理变化。采集其心、肝、脾、肺、肾、肠、淋巴结等组织脏器，其中一部分用4％多聚甲醛进行固定，另外一部分则于-20 ℃冻存备用。

1.3 病理切片制作

对采集的心、肝、脾、肺、肾、肠、淋巴结等组织脏器进行修块，之后置于4％多聚甲醛溶液中进行固定，经冲洗、脱水、透明、浸蜡、包埋等处理后进行切片，并对其进行H.E.染色。对制作好的病理切片，利用光学显微镜进行病理组织学观察。

1.4 病毒分离与鉴定

采集病死仔猪的淋巴结、脾脏、肺脏组织，加入灭菌的PBS匀浆研磨制成悬液，之后5 000 r/min 离心15 min，吸取离心上清液，按20％比例加入配制的双抗溶液，4 ℃感作过夜。经0.22 µm滤器进行无菌处理后，将其接种于长至单层的PK-15细胞，37 ℃吸附1.5 h后，加入含2％胎牛血清的DMEM维持液，同时设立正常细胞对照。在37 ℃、5％ CO2培养箱中继续培养72 h后收获第1代病毒，由于PCV2不引起PK-15细胞病变，因此继续盲传12代，每隔3代收集接种细胞培养液，提取病毒DNA进行PCR检测。用于PCR检测的引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列为P1：5′-AGAAACAAGTGGTGGGACG-3′；P2：5′-AGGAGTTGACGACAGGGTC-3′。PCR扩增体系为：10×PCR Buffer 2.5 µL，rTaqDNA聚合酶 0.25 µL，dNTP Mixture 0.75 µL，基因组DNA模板 1 µL，P1 1 µL，P2 1 µL，补加ddH2O至25 µL。PCR反应条件为：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性5 min，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共30个循环；最后72 ℃延伸10 min。PCR扩增结束后，取7 µL PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。

1.5 PCV2-JL/China/2015全基因组测序

利用Primer 5.0软件设计合成1对特异性引物用于PCV2-JL/China/2015全基因序列扩增，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物序列为，P3：5′-GCGAATTCAACCTTAACCTTTCTTATTC-3′；P4：5′-ATGAATTCTGGCCCTGCTCCC-3′。

收集1.4中经PCR鉴定为阳性的细胞悬液，反复冻融3次后，5 000 r/min 离心15 min，吸取离心上清液，利用病毒DNA抽提试剂盒抽提病毒基因组DNA，并以此为模板进行PCR扩增。PCR扩增体系为：10×PCR Buffer 2.5 µL，rTaqDNA聚合酶0.25 µL，dNTP Mixture 0.75 µL，基因组DNA模板1 µL，P3 1 µL，P4 1 µL，补加ddH2O至25 µL。PCR反应条件为：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性5 min，56.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 40 s，共30个循环；最后72 ℃延伸10 min。PCR扩增结束后，取7 µL PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。凝胶电泳后，对目的片段进行切胶回收，将回收产物连接至pMD-18T载体，16 ℃连接过夜。将连接产物转化至DH5α感受态细胞中，经蓝白斑筛选可能插入目的片段的白色菌落。挑选单个白色菌落，接种于含AMP＋的LB液体培养基培养过夜。使用质粒提取试剂盒提取质粒，PCR、酶切鉴定筛选阳性质粒菌种，送吉林省库美生物公司进行测序。

1.6 PCV2-JL/China/2015全基因序列分析

利用DNAstar和MEGA5.2等软件对PCV2-JL/ China/2015毒株进行全基因组序列的同源性比较和序列分析，并构建系统发育进化树，分析其遗传变异情况。

2 结果与分析

2.1 临床及病理剖检变化

病猪表现为呼吸困难，被毛蓬乱，皮肤表面可见有明显的红色丘疹（图1A），腹泻严重。

剖检发现，病猪肺脏肿大，间质增宽，呈现间质性肺炎变化（图1B）；肾脏水肿且表面散在有灰白色坏死灶；脾脏肿大，边缘有严重的梗死，质地较硬（图1C）；胃肠黏膜充血，出血；腹股沟淋巴结肿大，外观呈灰白色，切面外翻。其他组织器官无明显病变。

图1 疑似PCV-2感染仔猪临床及病理剖检变化（注：A. 皮肤表面可见紫红色丘疹；B. 间质性肺炎；C. 脾脏坏死）

2.2 病理组织学观察结果

镜检，肺脏支气管周围可见有大量的淋巴细胞浸润，呈现小叶性肺炎的变化（图2A），肺间质和血管腔内充满均质淡粉红色水肿液，并呈现间质性肺炎变化（图2B）。脾脏脾小体淋巴细胞结构疏松，生发中心不明显，副皮质区增宽，动脉周围淋巴鞘明显增厚（图2C）。淋巴小结内有大量的单核细胞浸润，呈现出浆液性淋巴结炎的病理变化（图2D）。脑组织充血、淤血，小血管及胶质细胞呈现水肿变化（图2E），并出现明显的噬神经现象（图2F）。

图2 采自疑似PCV-2感染仔猪脏器的病理组织学观察（注：A. 支气管肺炎；B. 肺水肿，间质性肺炎；C. 脾脏动脉周围淋巴鞘增厚；D. 浆液性淋巴结炎；E. 脑水肿；F. 噬神经现象）

2.3 病毒分离

将病料处理上清液接种至长满单层的PK-15细胞进行病毒的分离，与正常细胞对照相比，接种病料上清液的细胞未见有细胞致病效应（CPE）出现，继续盲传至第12代，选取第1、3、6、9、12代细胞培养液进行PCR鉴定，结果显示，均扩增出与预期目的基因片段大小一致的条带，约为494 bp（图3）。

图3 病料接种PK-15细胞中PCV2的PCR鉴定结果（M：DLMarker 2000；1～5：第1、3、6、9、12代细胞培养液的PCR扩增结果；6：阳性对照；7：阴性对照）

2.4 PCV2-JL/China/2015全基因组测序结果

利用P3和P4对2.3鉴定为阳性的细胞液进行PCR扩增，结果显示，扩增获得与预期片段大小一致的目的条带，长度约为1 767 bp（图4）。回收PCR扩增产物回收后，与pMD18-T克隆载体连接，构建pMD18-T-PCV2的重组质粒并对其进行测序，结果显示PCV2-JL/China/2015分离株的大小为1 767 bp。

图4 PCV2-JL/China/2015全基因组PCR扩增结果（M：DLMarker 2000；1～4：PCR扩增产物；5：阴性对照）

2.5 遗传进化树分析

将所测定的PCV2-JL/China/2015分离株全基因组与GenBank中公布的来自中国、德国、英国、朝鲜等多个国家和地区共计12个PCV2毒株进行序列比较，应用DNAStar软件包中MegAlign软件的Clustal V方法计算遗传距离，根据遗传距离绘制核苷酸系统发育进化树（图5）。结果表明，PCV2-JL/China/2015分离株与我国的湖南长沙FJ594471-1C01毒株的亲缘关系较近。

图5 PCV2-JL/China/2015分离株全基因组的进化树分析

3 讨论

近年来，猪圆环病毒在世界多个国家和地区广泛流行，如法国、德国、西班牙、美国、丹麦等。此外，该病也先后在我国湖北、湖南、河北、吉林等十多个省份发生，并呈现出蔓延的趋势，严重制约了我国养猪业的发展[3-5]。猪圆环病毒（PCV）作为断奶仔猪多系统衰竭综合征的主要病原，以侵害断奶仔猪的免疫器官为主，如脾脏、体表淋巴结等，导致感染仔猪免疫力和抵抗力的下降，进而诱发其他病原的继发感染或混合感染，给养猪业造成严重的经济损失[6-7]。

本试验对2014年12月吉林省长春郊区一养猪户饲养猪群发生疑似猪圆环病毒病疫情进行探讨分析，从病原学和病理学角度出发，利用大体病理剖检、病理组织学观察、病原分离、PCR等方法进行检测。一方面对送检病死仔猪进行了常规的病理剖检，另一方面采集其心、肝、脾、肺、肾、脑以及肠等各组织脏器进行病理学切片，从眼观病理变化和镜下病理组织学角度对其死亡病因进行分析。病理组织学观察结果表明，其肺脏、脾脏、淋巴结以及脑等组织脏器均发生病变，其中肺脏呈现间质性肺炎、肺水肿、支气管肺炎的变化。通常间质性肺炎多发生于病毒感染的情况下，而且支气管周围有大量淋巴细胞浸润，据此可以推测该病的发生原因很可能为病毒感染所致。发生间质性肺炎时，由于肺间质增宽，导致肺泡表面的活性物质减少，肺的顺应性降低，呼吸膜增厚，因而引起肺换气障碍，致使病猪在临床上表现呼吸困难等症状。脾脏动脉周围淋巴鞘增厚，富含大量的T淋巴细胞，表明该病原引起的免疫反应以细胞免疫为主。脑表现出水肿、非化脓性脑炎的变化，致使病猪临床上出现震颤等神经症状。另一方面，利用PK-15细胞从脾脏、淋巴结等组织中进行病毒的分离[8-9]，由于PCV2不引起CPE的产生，因此在PCV2分离过程中，对接种病料上清液后第1、3、6、9、12代细胞培养液进行PCR鉴定，结果显示，均扩增出与预期目的基因片段大小一致长约494 bp的条带，该结果表明本研究成功分离获得1株病毒，并将该分离毒株命名为PCV2-JL/China/2015。为了进一步明确该分离株的分子特性，利用PCR扩增获得PCV2-JL/China/2015的全基因组序列，并在此基础上进行遗传进化树分析，结果显示，该分离株与我国湖南长沙病毒株FJ594471-1C01分离株亲缘关系较近，处于同一进化分支上。本研究结果不仅为PCVD的临床诊断、病理学研究提供理论依据，并为进一步开展PCV2病原学、疫苗的研制以及防控措施的制定奠定基础。

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Isolation and Identification of Porcine Circovirus 2（PCV2）Isolated from Jilin Province and Its Complete Genome Sequence Analysis

WANG Dong-yuan1,2, WANG Yu-shun2, GU Yu2, JIN Tian-ming3, GAO Feng1,CorrespondingAuthor
（1. College of Veterinary Medicine, Jilin University, Changchun 130062, China; 2. Beichen Breeding Industry Development Service Center, Tianjin 300400, China; 3. College of Animal Science and Veterinary, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China）

An suspected porcine circovirus disease was confirmed by necropsy, histopathology observation, virus isolation and PCR detection, which was caused by porcine circovirus 2（PCV2） infection. A porcine circovirus strain（PCV2-JL/China/2015）was successfully isolated fromspleens and lymph nodesby passaging in PK-15 cells. A pair of primers based on PCV2 was designed according to the published sequences in GenBank. The length of complete genome of PCV2-JL/China/2015 was 1 767 bp by sequencing analysis. The results of the phylogenetic tree analysis indicated that there was a close genetic relationship between PCV2-JL/China/2015 and FJ594471-1C01 isolate from Changsha city.

porcine circovirus 2; isolation and identification; complete genome sequence

S852.65

A

1008-5394（2016）04-0043-04

2016-07-18

国家重点研发计划项目“猪重要疫病的诊断与检测新技术研究（猪重要疫病混合感染鉴别诊断技术研究）”（2016YFD050 0707）；天津市优秀科技特派员项目“规模化猪场腹泻病的监测及净化技术研究”（16JCTPJC45000）；天津市农业科技成果转化与推广项目“规模化猪场仔猪腹泻病的监测及防控技术推广”（201601380）

王东源（1981-），男，天津市人，兽医师，学士，主要从事临床兽医诊断工作。E-mail：xdtzxz@163.com。

高丰（1961-），男，吉林大安人，教授，博士，主要从事兽医病理学的教学和科研工作。E-mail：gaofeng@jlu.edu.cn。