盐胁迫下耐盐苜蓿松散型愈伤组织生理生化特性变化

杨静慧，吴志瑜，刘艳军，秦艳筠，李 冰，黄唯子

（1. 天津农学院 园艺园林学院，天津 300384；2. 天狮学院工商管理学院，天津 301700）

盐胁迫下耐盐苜蓿松散型愈伤组织生理生化特性变化

杨静慧1，吴志瑜1，刘艳军1，秦艳筠1，李 冰2，黄唯子1

（1. 天津农学院 园艺园林学院，天津 300384；2. 天狮学院工商管理学院，天津 301700）

为了解盐胁迫下耐盐突变苜蓿的生理生化变化，以青睐苜蓿耐盐突变体的松散型愈伤组织和青睐苜蓿松散型愈伤组织为试材，用2％NaCl溶液浸泡1 h，分析了该组织在盐胁迫下细胞中的可溶性糖、丙二醛、可溶性蛋白、游离脯氨酸等的含量，以及细胞膜透性、离子浓度和SOD、POD酶活性。结果显示：盐胁迫下耐盐松散型愈伤比对照组织的可溶性糖含量、POD酶活性、游离脯氨酸含量、K＋/ Na＋分别高出0.757倍、0.266倍、6.525倍、0.700倍，SOD酶活性、丙二醛含量、细胞膜透性、Na＋、K＋浓度分别低1.807倍、0.878倍、0.553倍、2.903倍、1.296倍。所以，耐盐松散型愈伤组织在盐胁迫下表现出可溶性糖含量、POD活性、游离脯氨酸含量、K＋/ Na＋增加，丙二醛含量、细胞膜透性、Na＋浓度降低，可溶性蛋白无明显变化。试验结果表明苜蓿耐盐突变愈伤组织具有更强的耐盐性。

苜蓿；松散型；愈伤组织；盐胁迫；生理生化

苜蓿是重要的饲料植物，被世界各地广泛引种栽培。苜蓿具有改良土壤的作用，并且耐干旱、耐寒、较耐盐碱、耐瘠薄。苜蓿还可以作为景观野生花卉，用于建造花镜和作为地被植物使用。已有许多学者对苜蓿的耐盐性进行了研究[1-4]。但是，现有的苜蓿品种仅仅能在轻度盐碱地上生长，培育高耐盐的苜蓿品种仍然是许多研究人员努力的方向。开发和研究这种兼土壤改良、牧草、观赏于一身的植物，有非常广阔的应用前景。但是，目前获得的高耐盐的苜蓿品种较少，加之转基因技术在应用上的限制，使许多学者转向了盐胁迫体细胞诱变育种研究[5-9]。耐盐诱变育种是在将细胞放在高盐培养基上，通过盐致死浓度筛选抗盐细胞，并通过细胞再生和体细胞胚诱导、耐盐筛选和鉴定等方法获得耐盐突变体。本试验通过松散型愈伤组织进行高盐胁迫筛选，获得的再生耐盐细胞系为单细胞克隆，避免了嵌合体[10]。

本试验以已经筛选出的耐盐突变细胞系为材料，通过分析其愈伤组织在盐胁迫下8项生理指标的变化，研究其耐盐机理，旨在为耐盐育种提供理论依据。

1 材料与方法

试验使用的对照苜蓿品种青睐购于中国农科院，耐盐愈伤组织由天津农学院植物教研室提供，通过高盐筛选获得的突变体细胞系，方法见Qin Yanjun等[9]和刘艳军等[10]的研究报道。

取耐盐突变体和对照（青睐苜蓿）的子叶在MS＋0.25mg/L 2,4-D ＋ 0.5 mg/L KT＋150 mg/L Vc＋30 g/L 蔗糖培养基上进行愈伤组织的培养，并按照刘艳军等[10]的培养方法获得松散型耐盐愈伤组织和普通愈伤组织（对照）。

在预备试验中，根据苜蓿植株在土壤中的耐盐浓度（0.25％），设定了NaCl胁迫的筛选浓度为0.5％～3％，处理1 h。结果是0.5％～1.5％的盐浓度处理有较多的细胞成活，2％的盐处理有个别细胞能够成活，2.5％～3％的盐处理细胞全部死亡（设计结果见表1）。因此，选择2％为盐胁迫筛选处理浓度。取松散型愈伤组织进行盐胁迫处理，每处理称取0.5 g，放进纱布中，浸入2％盐水中1 h。每处理3次重复。

表1 预试验设计结果

生理指标测定方法为：可溶性糖含量用蒽酮法、SOD酶活性用氮蓝四唑光化还原法、POD酶活性用采用愈创木酚比色法和Lambda35紫外分光光度计测定、丙二醛含量用硫代巴比妥酸比色法和用Lambda35紫外分光光度计测定、细胞膜透性用电导率法、可溶性蛋白含量用紫外吸收法、游离脯氨酸含量用茚三酮显色法、Na＋、K＋离子含量用原子分光光度计（PerkinElmer AAnalyst 400型）测定。每处理3次重复。

2 结果与分析

2.1 盐胁迫对耐盐愈伤组织可溶性糖含量的影响

图1可以看出，两种愈伤组织的可溶性糖含量差异较大。在盐胁迫的条件下，两种愈伤组织可溶性糖含量均有增加。耐盐愈伤组织可溶性糖含量为33.15％，对照为18.86％，耐盐愈伤组织是对照的1.75倍。据报道，盐胁迫下，可溶性糖含量增加，可使细胞的渗透势降低，提高组织持水能力[11]。可溶性糖增加有利于在逆境中保持水解酶类的稳定。所以，本试验中耐盐愈伤组织的耐盐性强与其盐胁迫下细胞可溶性糖含量增加较多有密切关系。

图1 盐胁迫对耐盐愈伤组织可溶性糖含量的影响

2.2 盐胁迫对耐盐愈伤组织SOD酶活性的影响

由图2可以看出，两种愈伤组织的差异很大。在盐胁迫下，两种愈伤组织SOD酶活性均增加,其中耐盐愈伤组织SOD酶活性为1.364 U，对照组织SOD酶活性为3.829 U，耐盐愈伤组织仅仅是对照的35.6％。说明盐胁迫对耐盐愈伤组织的SOD酶活性影响较小。盐胁迫下SOD活性变化在一定程度上反映了植物清除超氧阴离子的能力[12]。本试验中，耐盐愈伤组织的SOD酶活性低，与Benavides M P[13]等的研究结论一致。耐盐愈伤组织SOD酶增加的少，表示它受到盐胁迫后，表现出一定的应对能力，不至于SOD酶增加很多来应对逆境。所以较对照有较强的抗逆性。但也有报道：SOD含量越高，植物清除超氧离子能力越强[5]。

图2 盐胁迫对耐盐愈伤组织SOD酶活性的影响

2.3 盐胁迫对耐盐愈伤组织POD酶活性的影响

图3可以看出，两种愈伤组织具有一定差异。在盐胁迫的条件下，两种愈伤组织POD酶活性均增加。耐盐愈伤组织POD酶活性为30.62 U，愈伤组织POD酶活性为24.18 U，耐盐愈伤是对照的1.266倍。POD的增加有利于保持细胞膜的完整和稳定，减缓有毒物质的侵害，提高植物的抗逆性。有研究认为，POD酶活性增加多表示耐盐性强[14]。但是，也有相反的结论[15]。因而认为POD活性增加是一种胁迫症状，而不是一种抗性表现[16]。

图3 盐胁迫对耐盐愈伤组织POD酶活性的影响

2.4 盐胁迫对耐盐愈伤组织丙二醛含量的影响

图4可以看出，两种愈伤组织具有较大差异。在盐胁迫的条件下，两种愈伤组织丙二醛含量均降低。耐盐愈伤组织丙二醛含量为0.707 μmol/g，对照丙二醛含量为1.328 μmol/g，耐盐愈伤是对照的53.2％。丙二醛是膜脂过氧化的最终产物之一，使得膜系统中多种酶受到严重的损害，导致膜的完整性被破坏。抗盐性较强的牧草丙二醛含量低于抗逆性较差的牧草品种[17]。

图4 盐胁迫对耐盐愈伤组织丙二醛含量的影响

2.5 盐胁迫对耐盐愈伤组织细胞膜透性的影响

图5可以看出，两种愈伤组织有明显差异。在盐胁迫的条件下，两种愈伤组织细胞膜透性均不同程度的增加，其中耐盐愈伤组织的导电率较低，为48.035％，对照的较高，为74.589％，耐盐愈伤仅是对照的64.4％。在胁迫下，细胞膜会遭到破坏，膜透性通常增大，细胞内电解质外渗，电导率增大。朱建峰等[17]对小麦的耐盐性研究中，证实了在不同浓度的盐胁迫下，耐盐性强的品种细胞膜透性增加的较少,伤害率较低。所以，盐胁迫下膜透性小的抗逆性强。

图5 盐胁迫对耐盐愈伤组织细胞膜透性的影响

2.6 盐胁迫对耐盐愈伤组织可溶性蛋白质含量的影响

图6可以看出，两种愈伤组织无明显差异。在盐胁迫的条件下，耐盐愈伤组织可溶性蛋白质含量为1.831 mg/mL，对照为1.798 mg/mL，含量相近。大多数作物受到环境胁迫时在体内积累可溶性溶质，如可溶性蛋白质[18]和可溶性糖等，可溶性蛋白质含量的多少，能在一定程度反映了组织内部代谢的活跃程度[19]。本试验中耐盐愈伤和对照的可溶性糖含量差异较大，可溶性蛋白质差异不明显。这种现象是否与植物种类和逆境调节途径的不同有关。在本试验条件下，苜蓿愈伤组织可能主要是通过增加可溶性糖含量来增加耐盐性的。

图6 盐胁迫对耐盐愈伤组织可溶性蛋白质含量的影响

2.7 盐胁迫对耐盐愈伤组织游离脯氨酸含量的影响

图7可以看出，两种愈伤组织差异很大。在盐胁迫的条件下，耐盐愈伤组织游离脯氨酸含量为1230.7 μg/g，对照为163.54 μg/g，耐盐愈伤组织是对照的7.525倍。脯氨酸的含量在一定程度上反映出植物的抗逆性，抗逆性强的品种积累的脯氨酸也较多[20]。所以，盐胁迫下耐盐愈伤组织耐盐性强与其迅速增加的脯氨酸含量有密切关系。

图7 盐胁迫对耐盐愈伤组织游离脯氨酸含量的影响

2.8 盐胁迫对耐盐愈伤组织中Na＋、K＋含量的影响

图8可以看出，两者差异较大。在盐胁迫的条件下，对照愈伤组织Na＋和K＋含量分别为0.728 mg/L、4.426 mg/L，而耐盐愈伤组织Na＋和K＋含量为0.186 mg/L、1.928 mg/L，耐盐愈伤组织中Na＋的含量是对照的25.5％，K＋的含量是对照的43.6％。对照愈伤组织中的K＋/Na＋为6.081，耐盐愈伤组织K＋/Na＋为10.330，耐盐愈伤组织是对照的1.7倍。

通常盐胁迫下植物细胞中Na＋浓度不断增加，K＋浓度有所下降，如唐古特白刺愈伤组织中Na＋的积累和K＋的下降导致了细胞内Na＋/ K＋随时间而升高[12]。在盐胁迫下，K＋浓度高、Na＋浓度低有利于维持离子间的平衡，细胞可以免受伤害[21]。K＋/ Na＋比值低说明细胞的离子平衡被破坏[5]。所以，本试验中，耐盐愈伤组织的耐盐性与其在盐胁迫下细胞中维持较低的 Na＋和较高的K＋浓度有关。

图8 盐胁迫对耐盐愈伤组织中Na＋、K＋含量的影响

3 讨论

POD与SOD是植物体内的抗氧化酶。POD的增加有利于及时清除H2O2，防止H2O2反应产生毒性更强的·OH，损伤自身细胞[12]。SOD是生物体内清除自由基的重要酶，是植物抗逆性重要的抗性指标之一。它可以使超氧自由基与H＋结合生成H2O2和O2，清除O2-，从而维持活性氧的代谢平衡、保护细胞结构的透性[14]。SOD含量的变化与抗逆性的关系研究结果差异较大。有的研究认为，SOD含量越高，植物清除超氧离子能力越强，耐逆性也越强[5]。也有研究认为，盐胁迫过程中土豆盐敏感克隆的SOD活性明显增加，而耐盐克隆变化较小[13]。所以，盐胁迫下SOD酶活性变化在一定程度上反映了植物清除超氧阴离子的能力[12]。可能是一种胁迫症状，不是一种抗逆性表现。总之，逆境胁迫下植物抗氧化酶活性的变化可能因植物的种类、胁迫的程度等因素的不同而结果不尽相同[22]。

关于盐胁迫下细胞中可溶性蛋白的含量变化，不同种类的植物表现不同。唐古特白刺、西伯利亚白刺、竹柳、沙柳、乌柳、中华柽柳、甘蒙柽柳、刚毛柽柳等植物在盐胁迫下，植物的可溶性蛋白含量增加，增加了细胞的渗透势，增强了抵御外界的能力[23]。“徐薯25”、“徐薯26”和“徐薯18”等3个甘薯品种在盐胁迫下的可溶性蛋白含量差异显著，含量高的耐盐性强[24]。但是，Ashraf[25]及Ashraf和Fatima[26]对芝麻菜和红花的研究显示抗盐品种和不耐盐品种的叶片中可溶性蛋白含量并没有显著地差异，与本试验的结果一致。说明种间和品种间存在差异。所以，可溶性蛋白可否不作为苜蓿耐盐的筛选指标，还需要进一步的验证。

4 结论

盐胁迫下，耐盐愈伤组织具有更高的可溶性糖含量、POD活性、游离脯氨酸含量、K＋/ Na＋；更低的丙二醛含量、Na＋浓度和细胞膜透性。这是耐盐愈伤组织耐盐性增强的原因。

[1] 李波，徐婉玉，彭丹，等. 卫星搭载苜蓿种子叶片愈伤组织对逆境胁迫的响应[J]. 干旱地区农业研究，2015，33（8）：167-171.

[2] 田瑞娟，刘艳军，杨静慧，等. 不同激素不同外植体对苜蓿品种再生的影响[J]. 南方农业，2007，1（3）：13-14.

[3] 杜长城，杨静慧，任慧朝，等. 不同品种紫花苜蓿的耐盐性筛选试验[J]. 天津农业科学，2008，14（5）：14-16.

[4] 田瑞娟，杨静慧，梁国鲁，等. 不同品种紫花苜蓿耐盐性研究[J]. 西南农业大学学报，2006，28（6）：933-936.

[5] 张学云. 紫花苜蓿耐盐材料的鉴定及胚状体耐盐性诱变研究[D]. 北京：中国农业科学院，2013.

[6] Hu Yanyan，Yang Jinghui， Zhang Chao，et al. Difference of Cell Morphology on Different Callus Types of Alfalfa[J].Applied Mechanics and Materials，2015，707：137-143.

[7] 杨静慧，秦艳筠，刘婷，等. 两种愈伤组织生理生化特性和形态结构比较[J]. 天津农业科学，2014，20（8）：22-24.

[8] 苗博瑛，刘艳军，杨静慧. 黑莓松散型胚性愈伤组织的诱导[J]. 山西农业科学，2014，42（3）：209-212，216.

[9] Qin Yanjun，Gong Wuque，Liu Ting，et al． Difference of morphological structure and characteristics of physiology andbiochemistry between two types of alfalfa callus,（ICEMEE 2014）[J].Applied Mechanics and Materials，2015，700：306-309.

[10] 刘艳军，张超，杨静慧，等. 塔杨松散型均质胚性愈伤组织培养体系[J]. 植物研究，2016，36（1）：123-128.

[11] 薄鹏飞，孙秀玲，孙同虎，等. NaCl胁迫对海滨木槿抗氧化系统和渗透调节的影响[J]. 西北植物学报，2008，28（1）：113-118.

[12] 史如霞. NaCl胁迫对唐古特白刺愈伤组织生理生化特性的影响[D]. 兰州：西北师范大学，2010.

[13] Benavides M P，Marconi P L，Gallego S M，et al. relationship between antioxidant defense systems and salt tolerance in solanum tuberosum[J].Plant Physiology，2000，27：273-278.

[14] 孔凡岩. 百喜草体细胞耐盐突变体筛选及其生理生化特性研究[D]. 合肥：安徽农业大学，2010.

[15] 刘强. 五种木本植物对盐碱胁迫的生理响应及外源物质的作用[D]. 哈尔滨：东北林业大学，2009.

[16] 许鹏. 新疆荒漠区草地与水盐植物系统及优化生态模式[M]. 北京：科学出版社，1998.

[17] 朱建峰，田增荣，余玲，等. 小麦耐盐性基因型差异研究[J]. 甘肃农业科技，1996（8）：7-8.

[18] 曹翠玲，李生秀. 氮素形态对玉米幼苗碳水化合物及养分积累的影响[J]. 华中农业大学学报，2003，5（22）：457-461.

[19] 葛春辉. 亚麻胚性愈伤的诱导及耐盐愈伤的生理生化特性[D]. 乌鲁木齐：新疆大学，2007.

[20] 韦小敏. 玉米胚性愈伤组织耐盐变异体的筛选以及耐盐性分析[D]. 郑州：河南农业大学，2001.

[21] 陈少瑜，郎南军，贾利强，等. 干旱胁迫对坡柳等抗旱树种幼苗膜脂过氧化及保护酶活性的影响[J]. 植物研究，2006，26（1）：88-92.

[22] 陈少瑜，郎南军，贾利强，等. 干旱胁迫对坡柳等抗旱树种幼苗膜脂过氧化及保护酶活性的影响[J]. 植物研究，2006，26（1）：88-92.

[23] 武香.盐胁迫下植物的渗透调节及其适应性研究[D].北京：中国林业科学研究院，2012.

[24] 蔡翔君，关诗扬，过晓明. 盐胁迫对3中甘薯品种抗氧化酶及可溶性蛋白的影响[J]. 安徽农业科学，2012，40（17）：9228-9229.

[25] Ashraf M. Organic substances responsible for salt tolerance inEruca sativa[J]. Biologia Plantarum，1994，36（2）：255-259.

[26] Ashraf M，Fatima H. Responses of some salt tolerant and salt sensitive lines of safflower（Carthamus tinctoriusL.）[J]. Acta Physiol Plant，1995，17：61-71.

The Physiological and Biochemical Characteristics Changes of Loose Salt-tolerant Callus of Alfalfa under Salt Stress

YANG Jing-hui1, WU Zhi-yu1, LIU Yan-jun1, QIN Yan-jun1, LI Bing2, HUANG Wei-zi1
（1. College of Horticulture and Landscape, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China；2. College of Business Administration, Tianshi College, Tianjin 301700, China）

In order to understand the physiological and biochemical changes of alfalfa salt resistant mutant, the content of soluble sugar, malondialdehyde, soluble protein, free proline and the cell membrane permeability, ionic concentration and activity of SOD & POD enzyme were studied with loose salt-tolerant and ordinary callus of alfalfa and under 2％ salt stress. The results showed that the soluble sugar, POD enzyme activity, free proline and K＋/Na＋of loose salt-tolerant callus was respectively 0.757, 0.266, 6.525 and 0.700 times higher than control group. However, the SOD enzyme activity, malondialdehyde, cell membrane permeability, and Na＋& K＋was 1.807, 0.878, 0.553, 2.903 and 1.296 times lower than control group. In conclusion, Loose salt-tolerant callus increased in soluble sugar, POD activity, free proline and the ratio of K＋/Na＋under salt stress, while decreased in malondialdehyde cell membrane permeability and Na＋, furthermore there was no significant change in soluble protein. In short , alfalfa mutations salt-tolerant callus have more resistance.

alfalfa; loosely ;callus; salt stress; physiological and biochemical

S541.9

A

1008-5394（2016）04-0038-05

2016-03-22

天津市农业科技成果转化与推广项目“彩叶树优良品种繁殖、栽培技术示范与推广”（201502100）；天津市科技成果转化及产业化推进计划项目“优质彩叶北美海棠新品种种苗的规模化繁育”（14ZXNZNC0040）

杨静慧（1961 -），女，甘肃兰州人，教授，博士，主要从事园艺植物栽培、抗逆生理和分子育种研究。E-mail：jinghuiyang2@aliyun.com。