HIV暴露婴儿早期诊断实验室检测策略及意义

范文成，姚 均

·专题综述·

HIV暴露婴儿早期诊断实验室检测策略及意义

范文成，姚 均

对于HIV阳性孕妇所生的婴儿，由于被动接受了来自母亲的HIV抗体，出生后18个月内不能通过血清学检测进行HIV感染的诊断，因此HIV暴露婴儿早期诊断实验室检测策略不同于成人。目前暴露婴儿早期诊断实验室检测策略在国际上并没有统一的标准，但各国之间的检测策略大体一致，略有差异。近年来研究发现，尽早进行抗病毒治疗可以显著改善HIV感染婴儿结局，延长其生命。因此，早期诊断变得极为重要。本文就现行的HIV暴露婴儿早期诊断实验室检测策略进行综述，为尽早诊断HIV暴露婴儿感染状态，开展早期抗病毒治疗，消除儿童艾滋病提供支持。

母体胎儿间交换；HIV-1；早期诊断

HIV感染是全球面临的重大公共卫生问题，同样也严重威胁着妇女和儿童的健康与生命。如果HIV阳性孕妇未进行任何母婴阻断措施，HIV母婴传播率将高达30.0％～40.0％，目前我国母婴传播率控制在7.1％（全国平均），原因是仍有部分HIV感染的孕妇由于未及时接受孕产期保健服务和检测而未能被及时发现，得不到有效的母婴阻断干预，使得母婴传播率较高[1]。新生婴儿感染HIV后，其生命将受到严重威胁。有研究表明，小于2岁的HIV感染儿童，大约有50％病情迅速恶化并很快死亡[2-3]。HIV暴露婴儿早期检测，能够尽早对新生婴儿的HIV感染状态作出诊断，及时告知家庭，阴性检测结果有利于减轻家长心理负担，阳性检测结果的患儿可得到及时抗病毒治疗，这对保障感染儿童生命质量具有实质性益处[4]。2013年6月，联合国艾滋病规划署再次强调了“2015年消除儿童HIV感染”的全球目标，并提出实现该目标的12点建议，其中包括婴幼儿早期诊断检测及早治疗策略等未来研究方向[5-6]。因此，HIV感染新生儿及时诊断成为亟待解决的重要研究课题之一，本文即是针对目前现有的HIV婴儿早期检测策略研究进展作一综述。

1 现行的HIV暴露婴儿早期诊断实验室检测策略

1.1 WHO推荐策略 WHO在2013年《儿童抗病毒治疗指南》[7]中建议HIV阳性孕妇所生小于18月龄的HIV暴露的婴幼儿，按如下检测流程进行：①有病毒学检测条件的地区应在婴儿出生后4～6周进行病毒学检测，若检测呈阳性反应，则认为婴儿或儿童可能感染HIV，应立即进行抗病毒治疗，同时尽快采集第2份样品进行病毒学复检，如仍为阳性即可诊断感染。②当检测结果为阴性，若从未进行母乳喂养，则认为未感染HIV，若正在或曾经进行过母乳喂养，则在完全停止母乳喂养前仍有感染HIV的风险。③若条件限制，本实验室或本地区不能进行病毒学检测，则进行定期随访，如果随访过程中婴儿出现症状，应立即采样并将样品送到有病毒学检测能力的实验室进行检测，若检测结果为阳性，则认为婴儿或儿童可能感染HIV，应进行抗病毒治疗，同时尽快采集第二份样品进行病毒学复检，如仍为阳性即可诊断感染。若检测呈阴性反应，则在18月龄时和/或在停止母乳喂养6周后进行抗体检测。④若仍没有相关实验室能为其进行病毒学检测，则在婴儿9月龄时进行HIV抗体检测，抗体检测结果阳性并且又有相关症状，则婴儿或儿童可能被感染。若检测结果为阴性，则认为未感染。见图1。

图1 WHO婴幼儿早期诊断检测策略Figure 1 WHO early diagnosis and detection strategy for infants

1.2 美国实验室检测策略 对于出生后不满18月龄的婴儿，病毒学检测时间点依次为出生时（可选）2～3周龄、1～2月龄和4～6月龄。若检测结果为阳性，尽快采集第二份样本进行重复试验；若检测结果为阴性，则在下一个推荐的时间节点进行重复检测。只有连续2次独立的样本检测呈阳性结果可以确证婴儿HIV感染，排除HIV感染同样需要至少2个阴性结果，在婴儿1月龄后和4月龄后分别采集的两份样本最佳。指南中还对几种特殊情况进行了单独说明，包括后期血清转化，产后感染和HIV-2感染等。在2015年3月更新的美国抗病毒指南中，最迟的血清转化时间推迟到了24月龄，这对完善现行的各国婴幼儿早期诊断检测策略有着重要意义[8]。

1.3 中国实验室检测策略 《全国艾滋病检测技术规范》[9]中建议于婴儿出生后6周采集第一份血样本送检进行病毒学检测。若第一份血样本检测呈阳性反应，尽快采集第二份血样本进行病毒学检测。若2份病毒学血样本检测均呈阳性反应，诊断儿童HIV感染。若第二份病毒学检测呈阴性反应，待婴儿满3月龄再次采集血样本进行检测。若第一份血样本检测呈阴性反应，随访并待婴儿满3月龄再次采集血样本进行检测。

若婴儿3月龄核酸检测再次呈阴性反应，按照未感染儿童处理；于儿童12月龄时，开始HIV抗体检测，最终确定儿童感染状态。若婴儿3月龄核酸检测呈阳性反应，尽快再次采集血样本进行检测。若第三份血样本核酸检测呈阳性反应，诊断儿童感染；若第三份血样本检测呈阴性反应，婴儿未感染。

不同时间病毒学检测均呈阴性反应的喂哺母乳的儿童，应在完全停止喂哺母乳后的6周和3月龄（若6周时检测结果为阳性可尽快）再次采血进行核酸定性检测，儿童满18月龄后则可直接进行抗体检测。

如果婴儿第一次采血时已满3月龄，但未满12月龄，则应尽快在不同时间采集2份血样本；同时将2份血样本送检，按照前述流程进行检测。如果儿童第一次采血时已满12月龄，则应首先进行HIV抗体检测[9]。见图2。

图2 中国婴幼儿早期诊断检测策略Figure2 Chinese early diagnosis and detection strategy for infants

从以上各检测策略可以看出，当前各国现行的婴儿HIV感染早期诊断实验室检测在国际上虽没有统一的标准，但在检测时间、判定标准及排除方法等方面大致相同[10-11]：①小于18月龄为HIV阳性产妇所生的婴儿首选病毒学检测诊断是否感染HIV，且首次采样检测时间是4～6周龄，并强调2次病毒学检测结果阳性才能确定HIV感染；②在没有条件开展病毒学检测的地区，建议在婴儿9月龄后开始进行抗体检测。抗体检测具有特异性高、操作简单及花费低的特点。因为母亲透过胎盘屏障传给婴儿的IgG抗体大多于9个月后从未感染婴儿体内消失，因此，检测结果阴性可以用于婴儿排除HIV感染；③对于检测前有过母乳喂养史的婴儿，须在彻底停止母乳喂养6周后再次进行检测确认检测结果；④所有婴儿在18月龄时母源性抗体消退后须进行抗体确证试验，但最新的研究结果发现18月龄时个别婴幼儿体内的母源性抗体仍然存在。因此，美国最新抗病毒指南建议在24月龄时进行抗HIV抗体的确证试验[12]。

2 目前推荐的婴儿HIV感染早期诊断试验方法

2.1 核酸检测方法 核酸检测又可分为核酸定性检测与定量检测，定性检测又有商品化的试剂盒和实验室自建方法。目前在用的商品化试剂盒主要有以下几种。

2.1.1 罗氏公司的实时荧光PCR （real-time PCR）扩增试剂 包括用于定量的COBAS AmpliPrep /TaqMan HIV-1test和Amplicor HIV-1 Monitor，可使用血浆、血清或干血斑样本。扩增靶核酸位置是gag基因区，可扩增HIV-1 M组的A-H基因亚型。定量测定含量为50～750 000 copies/ml HIV-1 RNA。标准法的检测线性范围是400～750 000 copies/ml；超敏法的线性范围是50～100 000 copies/ml。定性试剂盒为AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 Qualitative Test v2.0，该试剂盒可同时扩增和检测HIV-1基因组中不受药物选择压力限制的2个不同区域。这种独特、双靶标设计，能够提供更可靠的检测结果，更准确诊断HIV感染。

2.1.2 雅培公司的M2000系统 可检测血浆、血清、全血或干血斑等多种样本。扩增靶核酸位置是pol基因区，扩增HIV-1基因亚型是M组的A-G亚型和O组以及N组病毒。定量检测试剂盒是Abbott RealTime HIV-1 Amplification Reagent，定量检测线性范围是40～1 000 000 copies/ml。定性检测试剂盒是Abbott RealTime HIV-1 Amplification Reagent Qualitative AMP Kit[13-14]。

2.1.3 生物梅里埃公司的NucliSensEasyQ HIV-1 Assay 9即核酸序列扩增技术 该技术也是目前国内常用的HIV RNA定量检测方法，主要用于HIV感染后病程进展检测和治疗效果监控评价，也可以作为检测婴幼儿HIV感染状态的间接手段。NuclisensEasyQ法使用血浆和干血斑样本进行RNA模板制备与核酸扩增。扩增靶核酸位置是gag基因区，扩增HIV-1基因亚型是M组的A-G亚型。检测线性范围是50～3 000 000 copies/ml[9]。

2.1.4 实验室自建方法 由各实验室自己设计引物，建立最优扩增体系，根据目的基因片段扩增有无来判断结果。中国疾病预防控制中心性病艾滋病中心参比室建立了3区联合巢式PCR（N3M-PCR, nested three-monoplexhiv -1 DNA PCR）。该方法使用3套引物对HIV-1的env、gag和pol基因区进行扩增，综合3区的扩增结果对新生儿的感染状况作出定性判断以达到婴幼儿HIV感染早期诊断的目的[15-16]。

此外，美国食品药品监督管理局也批准了Gen-Probe Aptima Qualitative HIV-1 RNA Assay方法进行婴幼儿早期诊断检测[17]。

总之，核酸定性检测结果可用于婴儿HIV感染早期诊断，核酸定量检测结果应结合流行病学与临床资料作为婴幼儿早期诊断的辅助方法[7]。

2.2 血清学检测方法 HIV阳性孕妇只有IgG抗体可以通过胎盘屏障进入胎儿体内，IgA、IgM、IgE 3种抗体是不能透过胎盘屏障的。因此，从原理上讲，在婴儿体内检测到3种抗体可以提示婴儿感染，但相关的研究证明，即使HIV感染婴儿，由于其免疫系统发展不完善，这3种抗体含量极低，用于诊断敏感性太低而难于实际应用[18]。同时有研究表明：宫内感染的婴儿被动获得的母亲的HIV IgG抗体，12～18个月之后才能全部消退，若在18个月内进行HIV抗体检测用于诊断感染，可能会出现假阳性结果[19]。因此WHO及许多国家推荐将血清学检测用于18月龄内婴儿排除HIV感染的手段。

2.3 流式细胞仪测定 国内外均有学者对使用CD4/CD8比值进行婴幼儿早期诊断进行研究，检测结果与实际结果一致性良好。该指标结合临床可以作为婴幼儿早期诊断的参考方法[20-21]。

综上所述，WHO建议HIV婴儿感染早期实验室诊断策略应该达到95％以上的灵敏度和98％以上的特异度[22]。目前各国现行检测策略虽然能够保证高灵敏度与高特异度，但这是通过相对延迟检测时间达到的。近年来的研究表明，如果HIV感染婴儿出生后6～12周内开始抗病毒治疗，可以使婴儿病死率降低76％，疾病进展减缓75％[23]。

在著名的“密西西比婴儿”案例中，研究人员在婴儿出生30 h后即使用外周血单核细胞进行HIV DNA PCR方法定性检测，检测结果阳性，随后在婴儿出生31 h后进行病毒载量检测，检测结果为19 812 copies/ml。临床医生立即用3种抗病毒药物——齐多夫定、拉米夫定和奈韦拉平进行鸡尾酒疗法。18月龄时治疗意外中断了5个月时间，再次就医时其HIV载量检测结果仍然小于最低检测线[24]。表明在停药后，仍成功抑制病毒。虽然2014年7月，曾被认为“治愈”的这名艾滋病女童在停药约2年后体内再次检测出HIV。但“密西西比婴儿”依然向科学家提供了有关HIV控制的至关重要的线索：对早期诊断阳性的感染婴儿及早治疗能够显著性减少HIV的复制并保持相当长的时间。同样，在2014年逆转录病毒及伺机感染会议上，研究人员对另一位出生后4 h早期诊断为阳性的感染患儿进行抗病毒治疗，婴儿在1、3、9月龄时病毒载量检测结果均小于最低检测线[25]。上述这2例婴儿早期的抗病毒治疗效果提示婴儿HIV感染检测时间越早，越有利于及早治疗，而及早实施抗病毒治疗可以带来良好的治疗效果。因此，美国纽约州推荐婴儿出生后立即或尽早进行检测，WHO在其2013年最新版的《治疗与预防HIV感染抗病毒药物应用指南》中，也建议所有5岁以下HIV暴露儿童应尽早诊断和尽早开始抗病毒治疗[26-27]。

目前我国正研究对HIV暴露婴儿在其出生后及时采血，制备成滤纸片干血斑样本进行HIV核酸检测，滤纸片干血斑制备仅需80 μl血液，采集简单，对婴儿伤害小，易于保存和运输，具有较高的敏感性和特异性[28]。该方法的应用将为我国HIV暴露婴儿尽早诊断，及时给予抗病毒治疗，阻断艾滋病母婴传播，乃至最终消除儿童HIV感染提供基本保证。

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（2015-11-02收稿 2015-12-02修回）

（责任编委 王永怡 本文编辑 张云辉）

Strategy and significance of early diagnosis laboratory detection in infants exposed to HIV

FAN Wen-cheng, YAO Jun*
National AIDS Reference Laboratory, National Center for AIDS/STD Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 102206, China

HIV-positive pregnant woman within 18 months born baby cannot be detected by serological testing of HIV infection, because of the passive acceptance of the HIV antibodies from the mother, So early diagnosis laboratory detection strategy of HIV exposed infants is different from the adults. At present, there is no uniform standard in the early diagnosis laboratory detection strategy internationally, but the detection strategy is generally consistent, slightly different. Recent studies have found that early antiviral therapy can significantly improve the outcome of HIV-infected infants and prolong their life. Therefore, early diagnosis becomes extremely important. In this paper, the current early diagnosis laboratory detection strategy of HIV exposed infants is reviewed for the early diagnosis of HIV exposure to infant infection status, carrying out early antiviral therapy and providing support for the elimination of children AIDS.

maternal-fetal exchange; HIV-1; early diagnosis

R563.12；R512.91

A

1007-8134(2016)06-0345-05

10.3969/j.issn.1007-8134.2016.06.007

国家科技重大专项（2015ZX10001001-002）

102206 北京，中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心艾滋病参比实验室（范文成、姚均）

姚均，E-mail: yaojuncdc@163.com

*Corresponding author, E-mail: yaojuncdc@163.com