BP神经网络结合正交试验优化海南‘罗非鱼’鱼皮提取胶原蛋白工艺

李新年，尚学峰，张玉苍,2，王江，2

(1.海南大学材料与化工学院，海南 海口 570228； 2.热带岛屿资源先进材料教育部重点实验室，海南 海口 570228)



BP神经网络结合正交试验优化海南‘罗非鱼’鱼皮提取胶原蛋白工艺

李新年1，尚学峰1，张玉苍1,2，王江1，2

(1.海南大学材料与化工学院，海南 海口 570228； 2.热带岛屿资源先进材料教育部重点实验室，海南 海口 570228)

【目的】 正交试验和BP神经网络模型优化鱼皮胶原蛋白提取工艺.【方法】 通过层次分析法(AHP)确定海南‘罗非鱼’鱼皮前处理工艺.采用酶提取法提取胶原蛋白，以胶原蛋白提取率为评价指标，正交试验设计考察NaCl浓度、乙酸浓度、提取时间及固液比对提取的影响，筛选最佳提取工艺.正交试验数据作为反向传播神经网络输入，对主要影响因素进行仿真优化.【结果】 优化得到的提取工艺条件为NaCl浓度2 mol/L，乙酸浓度0.2 mol/L，提取时间24 h，固液比1∶20(V/V)，检验样本的网络预测值和实际测量值相对误差为5%.【结论】 BP神经网络结合正交试验不需要增加试验次数，就能分析酶提取胶原蛋白影响因素的变化规律，找到最佳参数.

海南‘罗非鱼’；胶原蛋白；层次分析法；BP神经网络；酶法提取

我国是世界上最大的‘罗非鱼’养殖国、出口国和消费国，而海南省‘罗非鱼’出口量占全国的1/3.开发利用‘罗非鱼’加工下脚料具有巨大的经济和环保效应[1-2].‘罗非鱼’加工下脚料里含有大量的胶原蛋白，良好的生物相容性[3]，低抗原性和低过敏性[4]，使其在生物材料领域有广泛的研究应用[5].

酶提取胶原蛋白反应条件温和，具有较高的提取率，对蛋白质影响较小[6-8].1986年，Rumellhart等首次提出多层前馈网的反向传播学习方法，即BP神经网络.此后BP神经网络结合正交试验在提取工艺上逐步应用.张超等[9]利用BP神经网络结合正交试验优化苦参方中荆芥挥发油的提取工艺，预测值与实际值相对误差小于1%.邵方元等[10]采用BP神经网络结合正交试验优化胰蛋白酶提取鱼腥草多糖工艺，也成功得到最佳提取工艺.本试验采用BP神经网络结合正交试验法，以正交试验的数据为样本，建立提取工艺的BP神经网络模型，用神经网络模型预测最佳提取工艺，以期为海南‘罗非鱼’鱼皮胶原蛋白的提取提供参考.

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

海南‘罗非鱼’鱼皮(海南泉益公司)；胃蛋白酶(1∶3 000，生工生物工程股份有限公司)；马弗炉，KSL-1100X；冷冻干燥机FD-1A-50；台式高速离心机；TG16-WS.

1.2 基于层次分析法的鱼皮前处理工艺选取

1.2.1 海南‘罗非鱼’鱼皮成分测定 海南‘罗非鱼’鱼皮成分的测定方法如表1所列.

1.2.2 层次模型图构建 查阅相关文献[11-12]，经优化得到下表(表2).由此得到层次模型结构图，见图1.

表1 鱼皮成分测定方法

Tab.1 The method for skin component

检测项目检测方法水分含量测定CB5497-85粮食、油料检测水分测定法灰分含量测定GB5009.4-2010蛋白质含量测定GB5009.5-2010及第1号修改单(第一法)脂肪含量测定GB5009.6-2010

表2 鱼皮前处理工艺

Tab.2 Treatment process for fish skin

鱼皮前处理工艺P1P2P3P4试剂及步骤⑴NaOH浸泡6h⑵NaCl浸泡6h⑶乙醚⑴NaCl浸泡6h⑵NaOH浸泡6h⑶乙醚⑴NaOH浸泡6h⑵NaCl浸泡6h⑶正丁醇⑴NaCl浸泡6h⑵NaOH浸泡6h⑶正丁醇

图1 鱼皮前处理工艺层次模型结构Fig.1 Analytic hierarchy process for fish skin

1.3 鱼皮胶原蛋白提取工艺设计

1.3.1 鱼皮胶原蛋白的提取 称量已预处理的鱼皮50 g放入烧杯.加入含胃蛋白酶和冰醋酸(1%)，磁力搅拌溶解一定时间；高速离心机离心(12 000 r/min)吸取上清液.在上清液中加入NaCl至2 mol/L搅拌24 h；将所得沉淀低温冷冻干燥制成胶原蛋白样品，备用.

1.3.2 胶原蛋白含量的测定 胶原蛋白测定，采用分光光度法测定鱼皮中羟脯氨酸含量[13]，乘以相应的系数计算胶原蛋白含量.

1.3.3 正交试验设计 在单因素试验的基础上确定NaCl浓度、乙酸浓度、提取时间和固液比为考察因素，按L16(44)型表进行提取.以胶原蛋白提取率为评价指标，因素水平见表3.

1.3.4 BP神经网络试验设计

1.3.4.1 BP神经网络原理及方法 在BP神经网络中，对外部环境提供的模式样本进行学习训练，并能存储学习.经过学习之后的BP神经网络对外部环境有适应能力，能自动提取外部环境变化特征，输出学习训练过程中的特定结果.其实质为是一种按误差逆传播算法训练的多层前馈网络，原理如图2所示.

表3 提取影响因子水平表

Tab.3 The impact factor level table

水平因素A:NaCl浓度/(mol·L-1)B:乙酸浓度/(mol·L-1)C:提取时间/hD:固液比/(m∶V)110.131∶1021.50.291∶15320.3151∶2042.50.4241∶25

图2 BP神经网络原理Fig.2 The diagram of BP neural network

在BP神经网络中存在2种信号：函数信号和误差信号.其通过输入函数信号，通过每一层网络的神经元向前传播，到达网络输出层的末端即成为一个输出信号.与函数信号正相反，一个误差信号产生于网络的一个输出神经元，并沿着原来的连接通道反向传播.经过一定的训练次数，误差信号不断的反馈来调整，最终达到所需要的网络.

1.3.4.2 BP神经网络与正交试验结合依据 正交试验能反映全面试验结果，且不进行重复试验，利于节省.当讨论某一因素，其他因素不用考虑，这极其方便.但是正交试验对其指标贡献值大小的排序不是很准确.BP神经网络具有很强的学习模式，可以找出数据中人不能发现的隐藏的规律.但是BP神经网络的局限性也很明显.BP算法可以使网络权值收敛到一个解，但是很有可要会是一个局部最小值.

所以当采用正交试验得到试验数据保证大的方向是对的，根据BP对其所得到的数据进行学习预测，可以保证其指标的贡献较好的表达.这是因为正交试验利用多元线性回归方程来拟合试验数据而获取最优工艺，但是提取过程中受多因素、多水平的影响，需要考察的指标有很多，它们常呈非线性变化，使其很难对试验中各因素的变化规律做出准确的描述.

1.3.4.3 BP神经网络参数 在网络训练中，隐含层函数为tansig;输出层函数为purelin;其中期望误差、训练的最大次数和学习速率参数值分别为0.001、1 000、0.05.输入层以NaCl浓度，乙酸浓度，提取时间和固液比作为输入层，即输入层为4输出层只以胶原蛋白提取率输出层，即输出层层数为1.隐含层神经元数的选取能够直接影响到整个网络的学习效率和精确度.目前确定隐含层神经元数还缺乏相应的指导原则.参照文献[15-16]得到下式.

式中，m为输入层层数；n为输出层层数；l为隐含层层数；本文设隐含层为6，式中a为1～10的常数.

2 结果与分析

2.1 鱼皮组成成分

鱼皮处理后的基本成分分析见表4.从表4可知鱼皮蛋白质含量高达33.15%，羟脯氨酸测定胶原蛋白含量为25.32%，其纯度高达76.38%.说明‘罗非鱼’皮是很好的提取胶原蛋白的材料，也给鱼皮预处理提供了方向.

表4 海南‘罗非鱼’鱼皮营养成分Tab.4 Nutrient contents of the skin of tilapia %

2.2 层次分析法鱼皮前处理结果

由表5计算得出工艺排序结果，经过单排序和总排序一致性检验，得到组合权向量的权重，见表6.根据表6的结果可知对于鱼皮预处理效果的优先顺序为：P1>P2=P3>P4.选取NaOH浸泡6 h，随后NaCl浸泡6 h，最后用乙醚浸泡48 h.

表5 方案层对准则层的计算结果Tab.5 The calculation results

表6 方案层对目标层的权重Tab.6 Scheme layer on the target weight

2.3 鱼皮胶原蛋白提取单因素试验结果

图中看出，在1 mol/L到2.5 mol/L时，随着NaCl浓度的增加，提取率呈正相关，当浓度达到2.5 mol/L时，提取率达到最高.随后提取率随着浓度的增加有下降趋势，可能原因是NaCl浓度太大对胶原蛋白产生了一定的破坏；在0.1 mol/L到0.3 mol/L时呈正相关，此时达到最高提取率，随着乙酸浓度的增加，提取率呈负相关.这主要是由于胶原蛋白在较酸的环境下发生变性，导致提取率下降；若乙酸浓度太低，胶原蛋白则不能充分提取出来；提取时间中，21 h开始不再显著增长，故最佳提取时间为24 h，此时达到最大提取率46.23%；固液比在一定范围内的增长与提取率呈正相关.当固液比达到1∶25时已经开始下降，故最佳固液比为1∶20.

A：NaCl浓度；B：乙酸浓度；C：提取时间；D：固液比.图3 单因素对蛋白提取率影响Fig.3 Effect of single factor to rate of protein extraction

2.4 BP神经网络建立

以胶原蛋白提取率作为评价指标[17]，试验样本和结果见表7.

2.4.1 基于BP神经网络的胶原蛋白提取率预测 BP神经网络训练结果显示，经过70次训练后，网络的训练均方误差达到了设定的最小训练目标值，训练结果见图4.网络训练完后，利用MATLAB中的仿真函数sim进行仿真输出网络预测值，使用检验样本作为网络输入，对训练好的网络进行测试，测试结果表明网络的预测性能良好，测试结果见图5和表8.

BP神经网络的相对误差最好在5%以内，模拟所得数据在5%左右.可能原因是数据训练样本太少，模型参数还不完美.但是已经具备用于实际用途.

2.5 胶原蛋白红外分析

图4 BP神经网络训练Fig.4 The BP neural network training

图5 模拟值与真实值对比Fig.5 The simulation value and real value contrast figure

表8 BP神经网络相对误差表Tab.8 The BP neural network relative error table %

分析可知，3 321.24 cm-1处的吸收峰对应着赖氨酸残基中—NH伸缩振动、3 077.36 cm-1CN伸缩振动、2 927.24 cm-1—CH2不对称伸缩振动、2 855.56 cm-1—CH2对称伸缩振动、2 376.13 cm-1，1 652.00 cm-1处的吸收峰对应着胶原中羰基的伸缩振动[18]，此处归属于酰胺I的—C=O伸缩振动、1 542.74 cm-1—COO振动、1 453.17 cm-1—CH2弯曲振动[19].此外，通过对比胶原蛋白的标准图谱，发现两图非常接近，可以定性为胶原蛋白.胶原的红外光谱也可反映出胶原分子的二级结构信息，如酰胺I带中的羰基伸缩振动，及其与N-H弯曲振动、C-N振动的耦合，就是反应了胶原分子二级结构中的α螺旋、β折叠等信息.

图6 胶原蛋白的红外光谱Fig.6 Collagen infrared spectrum

2.6 胶原蛋白紫外分析

从图7中可以看出，提取胶原溶液的紫外光谱图中只存在一个较强的吸收峰，位于234 nm处，对比胶原在232 nm，此处吸收峰是胶原蛋白的特征吸收峰，是胶原区别于其他蛋白质的主要特征之一[20].

提取胶原蛋白和对比胶原蛋白的最大吸收峰略有差别，分析其原因，首先胶原蛋白的来源不同，且提取的方法不一样也可能造成最后胶原蛋白的氨基酸含量略有不同.此外，紫外分析也有一定的误差，但总体提取的胶原蛋白比较符合预期.

图7 胶原蛋白的紫外光谱Fig.7 Collagen ultraviolet spectrum

3 讨论与结论

本试验研究中，首先选用正交试验设计对‘罗非鱼’鱼皮胶原蛋白提取工艺中的多因素、多水平进行考察，再以正交试验数据为基础，经过有限次的迭代计算从而建立一个反映试验数据内在规律的BP神经网络模型，并对所建模型进行训练和仿真预测.检验样本的预测值和实际测量值相对误差在5%，表面网络模型预测性能良好.得到的最佳提取工艺为NaCl浓度2 mol/L,乙酸浓度0.2 mol/L，提取时间24 h，固液比1∶20.验证结果表明该工艺可行，具有重复性.

目前，鱼皮胶原蛋白提取工艺较为常用正交试验，由于其原理是利用多元线性回归方程来拟合试验数据而获取最优工艺.但是胶原蛋白提取过程复杂，影响因素很多，往往呈非线性变化.而BP神经网络是具有学习和处理非线性的最常用的模型之一.其通过反向传播来不断调整网络的权值和阀值，使网络的误差平方和最小，能很好的反映出对象的关系.将传统的方法—正交试验与BP神经网络相结合，可充分挖掘信息，模拟试验过程，反映各因素的变化规律，从而得到最优组合.

试验表明，采用BP神经网络结合正交试验，进行胶原蛋白提取工艺参数的优化是可行的.该方法不需要增加试验次数，就能分析因素变化规律和寻找最佳参数组合，为提取工艺提供一个参考.

[1] 段宙位.罗非鱼皮、鱼鳞、鱼尾的高效利用研究[D].海口:海南大学,2012

[2] 胡永和，蒋国洲.海南省农产品出口的现状、问题及对策[J].海南金融,2009(2):26-30

[3] 王静，陈佳，李音，等.羟基磷灰石/胶原蛋白/壳聚糖多孔支架的制备及性能研究[J].化工新型材料,2012(10):141-143

[4] 王红，张忠芮，黄嵩涛，等.静电纺丝素/胶原/聚(左旋乳酸-己内酯)三维纳米纤维支架及细胞相容性研究[J].化工新型材料,2014(4):84-87

[5] 李芳霞，卢金富，吴青松，等.聚氨酯改性明胶/壳聚糖复合膜的制备及性能研究[J].化工新型材料,2015(6):42-44

[6] 林莉，秦礼康，张伟.薏米糠蛋白的提取工艺优化及功能性质[J].食品科学,2015,36(2):46-51

[7] 程波，吴洁，张玉蓉，等.酶法提取人工养殖鲟鱼皮中的胶原蛋白的工艺研究[J].食品研究与开发,2009,30(3):1-4

[8] 邵伟，邓院芳，陈菽.鮰鱼皮胶原蛋白肽酶解法制备工艺条件研究[J].中国酿造,2010,20(7):120-123

[9] 张超，韩丽，杨秀梅，等.BP神经网络结合正交试验优化苦参方中荆芥挥发油的提取工艺[J].中成药,2015(1):70-74

[10] 邵方元，付腾飞，薛兴阳，等.正交试验和BP人工神经网络模型优化胰蛋白酶提取鱼腥草多糖的工艺[J].中国实验方剂学杂志,2013(11):14-17

[11] 任爱农，卢爱玲，田耀洲，等.层次分析法用于中药复方提取工艺的多重指标权重研究[J].中国中药杂志,2008,33(4):372-374

[12] 牛广俊，陈清英，朱思，等.用层次分析法多指标评价优选金花茶超声提取工艺[J].经济林研究，2015,33(1):119-122

[13] 夏光华，申铉日，蔡锦红，等.三酶法制备罗非鱼鱼皮胶原蛋白抗氧化肽及活性研究[J].食品科学,2012,33(23):175-179

[14] 日本食品工业学会《食品分析法》编辑委员会.食品分析法(下)[ M].重庆:四川科学技术出版社,1986[15] 高爱霞，陈艳艳，荣建.基于BP神经网络技术的路段实际通行能力[J].北京工业大学学报,2004(4):462-465

[16] Mirchandani G,Cao W.On hidden nodes for neural nets[C]∥Circuits and Systems,IEEE Transactions on,1989,36(5) :661-664

[17] 李细荣.基于神经网络的土密实度检测[J].甘肃农业大学学报,2015,50(4):175-180

[18] Valino F,Casals C,Guerrero R,et al.Inhaled nitric oxide affects endogenous surfactant in experimental lung transplantation[J].Transplantation,2004,77(6):812

[19] 李德富，周玉玲，穆畅道，等.超声波对溶液中胶原蛋白聚集体和三股螺旋结构的影响[J].皮革科学与工程,2009,19(5):14 -22

[20] Lee S J,Kim S Y,Lee Y M.Preparation of porous collagen/hyaluronic acid hybrid scaffolds for biomimetic functionalization through biochemical binding affnity[J].Wiley Interscience,2007,82(10):506-518

(责任编辑 李辛)

Extraction optimization of collagen from tilapia fish skin by back propagation neural network and orthogonal design

LI Xin-nian1,SHANG Xue-feng1,ZHANG Yu-cang1,2,WANG Jiang1,2

(1.College of Materials and Chemical Engineering,Hainan University,Haikou 570228,China;2.Key Laboratory of Ministry of Education for Advanced Materials in Tropical Island Resources,Haikou 570228,China)

【Objective】 To optimize collagen extraction techniques from fish skin by orthogonal test and BP neural network model. 【Method】 The analytic hierarchy process (AHP) was used to determine Hainan tilapia skin pretreatment. Enzymatic extraction method was conducted and the collagen extraction rate was as index,orthogonal test was based on four factors: NaCl concentration,acetic acid concentration,extraction time and solid-liquid ratio,the optimum technique was screened with the data of orthogonal test as back propagation neural network input. 【Result】 The optimized process conditions were NaCl at 2 mol/L,acetic acid at 0.2 mol/L,extracting for 24 h and solid-liquid ratio at 1∶20 (V/V). The relative error of network prediction and actual measured values were 5%. 【Conclusion】 The BP neural network combined with orthogonal experiment can analysis the changing of factors that affecting enzymes method and find the optimum parameters without increasing test number.

tilapia;collagen;analytic hierarchy process (AHP);BP neural network ;enzymatic method

李新年(1994-)，男，硕士研究生，研究方向为生物材料.E-mail:newyear200888@126.com

王江，男，博士，副教授，研究方向为生物材料.E-mail:wangjiang9623@126.com

海南省重点科技计划项目(ZDXM20120066)；海南省自然科学基金(511106).

2015-11-03；

2015-12-09

TS 254.9

A

1003-4315(2016)06-0115-06