五种甘肃道地中药对衰老模型小鼠皮肤的抗衰老作用研究

王昱

(陇南师范高等专科学校生化系， 甘肃 成县 742500)



五种甘肃道地中药对衰老模型小鼠皮肤的抗衰老作用研究

王昱

(陇南师范高等专科学校生化系， 甘肃 成县 742500)

【目的】 研究5种甘肃道地中药抗皮肤衰老作用的差异.【方法】 用D-半乳糖处理体外培养的小鼠皮肤成纤维细胞，分别用纹党、红芪、当归、大黄和半夏的水煎液干预后，试剂盒法检测皮肤成纤维细胞脂褐素(lipofuscin,LF)、羟脯氨酸(hydroxyproline,HYP)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)活性，ELISA法检测Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白含量，MTT法检测细胞增殖能力，流式细胞术检测细胞凋亡率，Western-blot检测Bax蛋白的表达情况.【结果】 与正常组相比，模型组小鼠皮肤成纤维细胞LF、MDA、Ⅲ型胶原蛋白含量、细胞凋亡及Bax蛋白表达显著增加，Ⅰ型胶原蛋白和HYP含量、细胞增殖能力及SOD、GSH-Px 活性均显著降低.与模型组比较，各中药组小鼠皮肤成纤维细胞LF、MDA、Ⅲ型胶原蛋白含量、细胞凋亡及Bax蛋白表达呈降低趋势，Ⅰ型胶原蛋白和HYP含量、细胞增殖能力及SOD、GSH-Px活性均呈增高趋势，其中纹党组和红芪组上述指标改变更为明显.【结论】 纹党、红芪、当归、大黄和半夏的水煎液可通过促进皮肤成纤维细胞增殖、提高抗氧化能力和抑制皮肤细胞凋亡发挥抗皮肤衰老的作用，纹党和红芪对皮肤的调节作用优于当归、大黄和半夏.

道地中药；皮肤成纤维细胞；氧化损伤；细胞凋亡；小鼠

人体衰老是一个全方位、多因素、系统的退行性过程，成为心血管疾病、癌症等许多疾病的危险因素，严重危害健康，影响生活质量，但其发生机制目前还不十分清楚[1].皮肤成纤维细胞是真皮内主要的修复细胞和创伤愈合的关键与基础，是皮肤老化过程中重要的效应细胞，也是分泌胶原蛋白的主要细胞，其正常的增殖、生长对于维持皮肤正常的结构和生理功能具有重要意义[2-3].中医药独特的理论体系为人们提供了一条有别于其他药物防治衰老的新治疗途径.由于中药具有活性成分多、作用靶点多、给药途径多、不良反应小等特点使其具有独特优势，在抗衰老的研究中显示出巨大的优势和潜力，其药理学功能有延缓衰老、抗氧化、调节体液免疫、促进淋巴细胞增殖、影响免疫器官的功能等[4-5].

甘肃省陇南地区的土壤、水质、气候、雨量等自然条件很适合中药材的生长，是中国主要中药材产地之一，如文县的纹党、武都的红芪、宕昌的当归、礼县的大黄和西和的半夏等道地中药材品种优良、疗效突出.已有文献报道，纹党、红芪、当归、大黄和半夏有延缓衰老、抗氧化、抗病毒、提高机体免疫力等功能[6-10].本研究旨在分析比较纹党、红芪、当归、大黄和半夏对衰老模型小鼠皮肤影响的差异，以期为进一步指导临床合理用药奠定基础.

1 材料与方法

1.1 试验材料

甘肃武都产红芪、宕昌产当归、文县产纹党、礼县产大黄、西和产半夏(由甘肃农业大学李唯教授鉴定)，D-半乳糖(北京优尼康生物科技)，刀豆蛋白 A(ConA)和四甲基偶氮唑盐(MTT)(美国Sigma 公司)，DMSO(上海碧云天生物技术公司)，脂褐素(LF)和羟脯氨酸(HYP)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)试剂盒(南京建成生物工程研究所)，Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白、兔抗Bax蛋白抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司)，细胞培养基DMEM(美国Gibco公司)，β-actin抗体、HRP标记的羊抗兔IgG(上海碧云天生物技术研究所)，0.45 μm 硝酸纤维膜(Solarbio公司).二氧化碳培养箱(日本 Sanyo公司)；FACS420型流式细胞仪(美国B-D公司生产)，SpectraMax M5型酶标仪(Molecular Devices,美国)，酶联免疫检测仪(ELx800，美国BioTek公司)，高速台式冷冻离心机(TGL-16M，Beckman美国)等.出生4 d清洁级昆明小鼠(兰州大学实验动物中心，生产许可证编号：SCXK(甘)2009-0004)，体质量(3±1)g.

1.2 试验方法

1.2.1 中药水煎剂溶液的制备 称取中药50 g置砂锅中，加10倍量水浸泡过夜，加热至沸，改用文火煎30 min，趁热滤过，滤渣另加8倍量水，同法煎煮30 min、滤过，合并2次滤液于烧杯中[11]，水浴浓缩后放凉至室温，100 mL容量瓶定容，倒入输液瓶中，盖薄膜，压胶塞和铝盖，高压灭菌(表压0.7 kg/cm2、115 ℃、30 min)，取出放凉稀释为1 g/kg溶液备用.

1.2.2 小鼠皮肤成纤维细胞的培养和给药 参照文献[12-13]，取小鼠背部皮肤，去除皮下脂肪，放入盛有无血清HBSS液(Hanks平衡盐缓冲溶液)的培养皿中冲洗，用眼科剪剪成1 mm3左右的碎块，0.25%胰蛋白酶和0.01%的EDTA消化液30 min，4 ℃消化3 h；分离表皮和真皮层，将真皮剪成0.5 mm3左右的小组织块，贴附于含DMEM培养液的玻璃壁表面，置于37 ℃、5% CO2培养箱中孵育，2～3 d换液1次，待细胞融合后，正常传代.将第4代成纤维细胞按1.0×106/瓶接种于25 cm2培养瓶中，当细胞至亚融合状态时，分别加入0(正常组)、D-半乳糖40 g/L(模型组)、红芪6 mg/mL+D-半乳糖40 g/L(红芪组)、当归6 mg/mL+D-半乳糖40 g/L(当归组)、纹党6 mg/mL+D-半乳糖40 g/L(纹党组)、大黄6 mg/mL+D-半乳糖40 g/L(大黄组)和半夏6 mg/mL+D-半乳糖40 g/L(半夏组)，置于37 ℃、5% CO2培养箱内培养48 h后，收集细胞备用.

1.2.3 皮肤细胞LF、HYP含量及抗氧化能力的测定 向给药后收集的细胞中加入适量的IP细胞裂解液，冰上作用30 min使细胞完全裂解，离心取上清液，严格按照试剂盒操作说明书测定细胞中LF、HYP、MDA含量及SOD、GSH-Px活性.

1.2.4 胶原蛋白含量的测定 同1.2.3法取上清液，按照ELISA检测试剂盒说明书操作，检测Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白的含量.

1.2.5 细胞凋亡的检测 将收集的成纤维细胞于预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)中，用弯头吸管反复吹打成单细胞悬液，离心 5 min(3 000 r/min)，弃上清液，用75%乙醇固定、4 ℃过夜，再用PBS洗涤离心、重新悬浮，调整细胞密度为1×106/mL，加入碘化丙啶(PI)100 μL和RNA酶50 μg，37 ℃孵育30 min后，用流式细胞仪测定细胞的凋亡情况.

1.2.6 成纤维细胞增殖能力的测定 将成纤维细胞悬液加入 96孔培养板，每孔100 μL，每个样本设8个复孔，其中4孔每孔加100 μL Con A(终浓度为 5 mg/L)，另外4孔作为对照，于37 ℃ 5% CO2饱和湿度条件下培养68 h，每孔加10 μL MTT(浓度为5 g/L)，在振荡器上振荡混匀，继续培养4 h.细胞培养终止后，弃上清，每孔加入100 μL DMSO，振荡混匀，静置数分钟，测定每孔的D570nm值.

1.2.7 Western-blot各组蛋白质表达 按照常规方法提取细胞总蛋白，BCA法测定总蛋白浓度.定量后稀释好的样品经过SDS-PAGE凝胶电泳，转膜、封闭(5%脱脂奶粉，用TBST稀释).将膜取出，加一抗Bax蛋白(浓度为1∶1 000)，4 ℃冰箱过夜，充分洗涤，加偶联辣根过氧化物酶(HRP)的二抗(浓度为1∶5 000)，室温下作用1 h，洗膜后加ECL发光液，以β-actin作为内参照，运用Image Lab软件进行曝光成像，采用Quantity one软件分析条带灰度值，试验重复3次.

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 成纤维细胞脂褐素(LF)、羟脯氨酸(HYP)含量的比较

与正常组相比，模型组成纤维细胞LF的含量显著增加，HYP的含量显著降低(P<0.01).纹党组、红芪组成纤维细胞LF的含量显著低于模型组，HYP的含量显著高于模型组(P<0.05)，纹党组成纤维细胞LF和HYP的含量与红芪组间无显著差异(P>0.05)，当归组、大黄组和半夏组间成纤维细胞LF和HYP的含量与模型组相比，无显著差异(P>0.05，图1).

同列数据标有不同大写字母者表示组间差异极显著(P<0.01)，标有不同小写字母者表示组间差异显著(P<0.05).图1 五种中药对成纤维细胞LF、HYP含量的影响Fig.1 Effects of five kinds of Chinese herbs on the contents of LF and HYP in fibroblast cells

2.2 细胞增殖能力的比较

与正常组相比，模型组成纤维细胞增殖能力极显著降低(P<0.01).纹党组、红芪组和当归组成纤维细胞增殖能力极显著高于模型组(P<0.05，P<0.01)，纹党组成纤维细胞增殖能力与红芪组和当归组差异显著(P<0.05)，红芪组成纤维细胞增殖能力与当归组间无显著差异(P>0.05)，大黄组和半夏组成纤维细胞增殖能力与模型组相比，无显著差异(P>0.05，图2).

图2 五种中药对细胞增殖能力的影响Fig.2 Effects of five kinds of Chinese herbs on the ability of cell proliferation

2.3 细胞抗氧化能力的比较

与正常组相比，模型组成纤维细胞SOD、GSH-Px活性显著降低，MDA含量显著增加(P<0.01).各给药组成纤维细胞SOD、GSH-Px活性均高于模型组，MDA含量均低于模型组，均有统计学差异(P<0.05).纹党组和红芪组成纤维细胞SOD、GSH-Px、MDA水平与当归组、大黄组和半夏组差异显著(P<0.05)，纹党组和红芪组间无差异(P>0.05)，当归组、大黄组和半夏组间无显著性差异(P>0.05，图3).

图3 五种中药对细胞SOD、GSH-Px、MDA水平的影响Fig.3 Effect of five kinds of Chinese herbs on levels of SOD,GSH-Px and MDA

2.4 Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白含量的比较

与正常组相比，模型组成纤维细胞Ⅰ型胶原蛋白含量极显著降低(P<0.01)，Ⅲ型胶原蛋白含量显著升高(P<0.05).与模型组相比，各给药组成纤维细胞Ⅰ型胶原蛋白含量均呈升高趋势，Ⅲ型胶原蛋白含量均呈降低趋势.纹党组和红芪组成纤维细胞Ⅰ型胶原蛋白含量显著高于模型组，Ⅲ型胶原蛋白含量显著低于模型组(P<0.05)，纹党组和红芪组间无显著差异(P>0.05).其余各给药组成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白含量与模型组相比，无显著差异(P>0.05，图4).

图4 五种中药对Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白含量的影响Fig.4 Effects of five kinds of Chinese herbs on contents of typeⅠand type Ⅲ collagen

2.5 成纤维细胞凋亡的比较

与正常组相比，模型组成纤维细胞的凋亡率显著升高(P<0.01).与模型组相比，各给药组成纤维细胞的凋亡率均呈降低趋势.纹党组、红芪组和当归组成纤维细胞的凋亡率显著低于模型组，差异具有显著性(P<0.05，P<0.01)，纹党组成纤维细胞的凋亡率与红芪组和当归组相比差异极显著(P<0.05)，红芪组成纤维细胞的凋亡率与当归组间无显著差异(P>0.05)，大黄组和半夏组成纤维细胞的凋亡率与模型组相比，无显著差异(P>0.05，图5).

图5 五种中药对细胞凋亡率的影响Fig.5 Effects of five kinds of Chinese herbs on apoptosis rate

2.6 Western-blot蛋白质表达的比较

与正常组比较，模型组成纤维细胞Bax蛋白表达明显增加，差异极显著(P<0.01).各给药组与模型组比较，纹党组、红芪组和当归组成纤维细胞Bax蛋白的表达降低明显(P<0.05，P<0.01).纹党组成纤维细胞Bax蛋白的表达显著低于红芪组和当归组(P<0.05)，红芪组和当归组间无显著差异(P>0.05).大黄组和半夏组成纤维细胞Bax蛋白表达与模型组比较均无明显差异(P>0.05，图6).Bax蛋白积分吸光度值与β-actin积分吸光度值的比值见图7.

1：正常组；2：模型组；3：纹党组；4：红芪组；5：当归组；6：大黄组；7：半夏组.图6 成纤维细胞Bax蛋白印迹分析Fig.6 The Western-blot result of Bax protein in fibroblast cells

图7 五种中药对成纤维细胞Bax蛋白表达的影响Fig.7 Effects of five kinds of Chinese herbs on expression of Bax protein in fibroblast cells

3 讨论

衰老是机体的生理功能逐渐下降，组织器官逐步发生退行性改变，并最终走向死亡的过程.据文献报道，纹党、红芪、当归、大黄、半夏及其有效提取物能调节机体免疫系统、增强抗氧化能力等，具有抗衰老、降血糖、抗肿瘤等生理功能[6-10].为了更好区别纹党、红芪、当归、大黄和半夏药理作用，试验从促进细胞增殖力、抗氧化及抑制皮肤细胞凋亡等相关指标着手，探讨纹党、红芪、当归、大黄和半夏水提物对衰老皮肤成纤维细胞的影响.

皮肤衰老的特征是失去弹性和柔软性，出现皱纹、干燥角化、色素过量沉积等.自由基学说认为机体氧化-抗氧化平衡障碍与衰老的发生与发展密切相关[14]，体内如SOD、GSH-Px等抗氧化酶活性降低，清除自由基能力下降，脂质过氧化终产物MDA增多，导致细胞凋亡或坏死[15]，从而引起皮肤的衰老.研究表明[16]，随着年龄增加，体内MDA含量增高，SOD、GSH-Px等抗氧化酶活性降低，且SOD、GSH-Px活性与物种寿命呈正相关.MDA是活泼的交联剂，可与蛋白质、肽类、脂类结合，在衰老的细胞中形成LF，出现黄褐色老年斑.LF为黄褐色不规则小体，是溶酶体作用后剩下不再能被消化的物质而形成的残余体，其含量随年龄增长而增多，是衰老的重要指征之一[17].

皮肤是否保持光滑细嫩主要取决于真皮下的胶原蛋白.胶原蛋白作为细胞外基质的主要成分，主要包括Ⅰ型胶原蛋白(约85%)、Ⅲ型胶原蛋白(约10%)及其他类型的胶原蛋白(约5%).Ⅰ型胶原在真皮中聚集成束，交织成网，赋予皮肤机械性与充盈感，维持皮肤张力；Ⅲ型胶原是一种幼稚的胶原纤维，是构成真皮中网状纤维的主要成分.当皮肤衰老时，Ⅰ型胶原蛋白越来越少，Ⅲ型胶原蛋白逐渐增多，真皮中胶原整体由Ⅰ型向Ⅲ型胶原转变[18].HYP是胶原纤维与胶原蛋白中的一种重要而且含量稳定的氨基酸，约占其总量13.4%，机体内自由基大量增加可引起胶原蛋白交联、老化，失去弹性[19].

本试验结果显示，模型组小鼠皮肤成纤维细胞LF、MDA、Ⅲ型胶原蛋白含量、细胞凋亡率及Bax蛋白表达显著增加，Ⅰ型胶原蛋白和HYP含量、细胞增殖能力及SOD、GSH-Px 活性均显著降低.中药纹党、红芪、当归、大黄和半夏可降低皮肤成纤维细胞LF、MDA、Ⅲ型胶原蛋白含量、细胞凋亡率及Bax蛋白的表达，增加Ⅰ型胶原蛋白和HYP含量、提高细胞增殖能力及SOD、GSH-Px的活性，其中纹党组、红芪组皮肤成纤维细胞的上述指标与模型组间差异显著，提示这5种道地中药在促进皮肤成纤维细胞增殖、抗脂质过氧化和清除氧自由基及抑制皮肤细胞凋亡的作用方面具有相似的药理作用，而纹党、红芪在延缓小鼠皮肤的衰老方面优于当归、大黄和半夏.多糖类成分是近年来中药天然药物研究领域中倍受关注的一类重要成分，其药理作用广泛，独特的生物活性和低毒特点在临床应用中具有极大的潜力[20].多糖也是中药纹党、红芪、当归、大黄和半夏的重要活性成分之一，其在药理学方面的研究已有大量报道[6-10].红芪、黄芪和当归等中药的水提物对机体免疫系统、神经系统、内分泌系统均有广泛的作用[21-22].但纹党、红芪、当归、大黄和半夏的主要活性成分各异，生物学效应也不尽相同，抗衰老机制是否相同？还需进一步研究.

综上所述，纹党、红芪等水煎液对衰老模型小鼠的皮肤均有不同程度调整作用，尤以纹党、红芪作用为甚.这种作用可能与皮肤成纤维细胞的抗氧化酶活性、细胞增殖力、细胞凋亡等变化有关.据此，在治疗临床皮肤衰老进程时可以优选纹党和红芪，也为道地中药复方的开发提供了试验依据.

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(责任编辑 李辛)

Anti-aging action of five Gansu genuine traditional Chinese medicines on the skin of aging model mice

WANG Yu

(Department of Biology and Chemistry,Longnan Teachers College,Chengxian 742500,China)

【Objective】 To research the difference in anti-aging effect of five kinds of Gansu genuine Chinese herbal medicines on skin of the aging model mice.【Method】 The mice skin fibroblast cells cultured in vitro induced by D-galactose were treated with the water decoction ofCodonopsispilosula,Astragaliradix,Angelicasinensis,RheumpalmatumandPinelliaternateto measure the content of lipofuscin (LF),hydroxyproline (HYP) and malondialdehyde (MDA),activities of superoxide dismutase (SOD) and glutathione peroxidase (GSH-Px) by commercial kit.The contents of typeⅠand type Ⅲ collagen and cell proliferation was determined by ELISA and MTT method,respectively.The apoptosis rate and expression of Bax protein was detected by flow cytometry and Western blot,respectively.【Result】 Compared with normal control group,the levels of LF,MDA,type Ⅲ collagen,cell apoptosis and Bax protein expression in skin fibroblast cells markedly increased in aging model group,but the content of typeⅠcollagen and HYP,cell proliferation and activities of SOD、GSH-Px reduced significantly.Compared with model group,the levels of LF,MDA,type Ⅲ collagen,cell apoptosis and Bax protein expression in skin fibroblast cells showed decreasing trend,however,the content of typeⅠcollagen and HYP,cell proliferation and activities of SOD、GSH-Px tended to increase in herb groups and the above indexes changed more significant in theCodonopsispilosulagroup andAstragaliradixgroup.【Conclusion】 The water decoction ofCodonopsispilosula,Astragaliradix,Angelicasinensis,RheumpalmatumandPinelliaternatacould exert antiaging effect on aging in skin fibroblast cells by enhancing cell proliferation,antioxidant capacity and inhibiting apoptosis.CodonopsispilosulaandAstragaliradixhad better regulation effects on skin thanAngelicasinensis,RheumpalmatumandPinelliaternata.

genuine traditional Chinese medicines;skin fibroblast cells;oxidative damage;apoptosis;mouse

王昱(1973-)，男，教授，硕士，研究方向为天然产物药理研究.E-mail:gswangyu@126.com

甘肃省自然科学基金项目(1107RJZK243);甘肃省高等学校科研资助项目(2015B-148).

2015-10-12；

2016-04-08

R 28

A

1003-4315(2016)06-0011-06