沙冬青总黄酮体外抗BPIV-3的试验研究

张嘉男，陶波，黄志浩，方梅，贾宁

(甘肃农业大学动物医学院，甘肃 兰州 730070)



沙冬青总黄酮体外抗BPIV-3的试验研究

张嘉男，陶波，黄志浩，方梅，贾宁

(甘肃农业大学动物医学院，甘肃 兰州 730070)

【目的】 研究沙冬青总黄酮体外抗牛副流感病毒Ⅲ型(BPIV-3)的作用，并对其抗病毒作用机制进行探讨.【方法】 以细胞存活率和抑制率为指标，采用MTT比色法检测沙冬青总黄酮抗BPIV-3活性.分别以感染病毒同时给药、给药后接种病毒、先感染病毒后给药3种方式观察沙冬青总黄酮对BPIV-3病毒的抑制效果.【结果】 沙冬青总黄酮的安全浓度为0.187 mg/mL，病毒半数细胞感染量(TCID50)为10-7.733/0.1 mL.在安全浓度范围内，沙冬青总黄酮具有良好的抗BPIV-3作用，且这种作用呈一定的量效关系.当浓度为0.187 mg/mL时，BPIV-3抑制率达89.43%，细胞存活率高达96.66%;当浓度为0.187 mg/mL时，阻断抑制率达68.36%，而细胞存活率达到86.98%；当浓度为0.187 mg/mL时，对BPIV-3复制抑制效果最明显，达到50.55%，而细胞存活率达到78.81%.同时，在安全浓度范围内，沙冬青总黄酮直接杀灭BPIV-3病毒的效力较阻断作用和抑制作用更强.【结论】 沙冬青总黄酮具有良好体外抗牛副流感病毒Ⅲ型(BPIV-3)的作用.

沙冬青总黄酮；抗病毒作用；BPIV-3；体外试验

牛副流感是由BPIV-3 (牛副流感病毒Ⅲ型)引起牛的一种以发热、气喘、流涎为特征的急性热性传染病，尤其多见于奶牛[1-2].本病流行范围很广，几乎全球所有奶牛养殖国均有该病爆发，给奶牛养殖业带来严重的威胁[1-4].到目前为止，本病尚无有效的化学治疗药物[2-3].已有研究表明，黄酮类化合物具有抗病毒、抗炎、免疫调节、抗肿瘤等多种生物学活性[5-9].沙冬青(AmmopiptanthusmongolicusCheng f.)为豆科旱生植物，主要分布于我国的西北地区以及蒙古、俄罗斯等国家.周建胜等[10]研究报道了沙冬青总黄酮具有抗BVDV(牛病毒性腹泻病毒)作用，且量效关系良好.本研究拟进行沙冬青总黄酮体外抗BPIV-3研究，以期为深入探索沙冬青总黄酮的抗病毒作用提供依据，另一方面也为利用沙冬青总黄酮抑制BPIV-3奠定基础.

1 材料与方法

1.1 沙冬青总黄酮的提取与制备

从甘肃省民勤县种子公司购入沙冬青种子，经洗净、晒干、粉碎备用.称取沙冬青种子干燥粉末，加75%乙醇，浸渍过夜.然后，在85～90 ℃水浴中回流循环提取，每次浸提2 h，提取3次，冷却，过滤，合并3次提取液.滤液经55 ℃减压浓缩成稠膏，加入50 ℃水搅拌溶解后，采用石油醚萃取两次进行脱脂，萃取上液石油醚回收利用，下液面进一步用乙酸乙酯萃取(每次萃取按1∶1加乙酸乙酯)，经多次萃取直到萃取液为无黄色物质为止.对乙酸乙酯萃取液用5%Na2CO3水溶液萃取，碱水溶液用浓盐酸调整pH 5～6后，再采用乙酸乙酯萃取，减压浓缩乙酸乙酯，60 ℃恒温干燥至恒量，即获得棕黄色的总黄酮类化合物.定量称取沙冬青种子总黄酮，加入二甲基亚砜(DMSO)溶解，原液浓度为12 mg/mL的沙冬青总黄酮浓度，用细胞维持液稀释成所需浓度，分装后于-20 ℃保存备用.

1.2 试验用细胞和BPIV-3

尕里巴牛肾原代细胞(MDBK)和BPIV-3(牛副流感病毒Ⅲ型)(批号217320，货号VR-739)由甘肃兰州民海生物公司提供.将液氮中冻存的MDBK细胞取出，放入40 ℃恒温水浴中迅速融化(1 min内).用750 mL/L乙醇擦拭冻存管，在无菌条件下，将细胞移入培养瓶中，加10 mL MEM生长液，37 ℃ 50 mL/L CO2培养箱内培养.传代时，移去旧培养液，加入3 mL PBS浸洗细胞2次，弃去缓冲液.加入2.5 g/L胰蛋白酶消化液轻摇培养瓶，放入37 ℃培养箱中消化3 min.弃消化液，加入10 mL MEM生长液，悬浮细胞并计数，将细胞悬液分装于培养瓶中，添加5～10 mL MEM生长液.置于37 ℃，50 mL/L CO2培养箱中继续培养至传代.所有试验均采用对数生长期细胞.

1.3 病毒半数细胞感染量(TCID50)的测定

取MDBK细胞常规培养至细胞长成单层，接种连续稀释10倍的10-1-10-10浓度的病毒液，每孔接种病毒稀释液100 μL，每个稀释度接种8孔，另设细胞正常对照，37 ℃吸附2 h，弃病毒液，用PBS液洗3次，每孔加维持液200 μL，将培养板置37 ℃ 50 mL/L CO2温箱中培养，逐日观察细胞病变(CPE)，记录病变程度和孔数，待细胞病变不再继续判定结果.按Reed-Muench公式计算TCID50.

1.4 沙冬青总黄酮对MDBK细胞的毒性试验

将沙冬青总黄酮母液(12 mg/mL)分别用细胞维持液按二倍递次稀释，组成浓度梯度.取对数生长期的MDBK细胞接种于96孔培养板中(200 μL/孔)，37 ℃、50 mL/L CO2培养箱中培养，待长成单层细胞后，将不同浓度的含药维持液0.1 mL接种于细胞培养板，每个浓度重复8孔，同时设置正常细胞对照组.培养48 h后，倒置显微镜下观察CPE(细胞病变)程度，弃培养液上清，每孔加入0.5 mg/mL MTT 100 μL，继续培养2～4 h，弃MTT上清，每孔加二甲基亚砜(DMSO) 100 μL，振荡5～10 min，待结晶完全溶解，用酶标仪检测 570 nm处的光密度(OD值)，根据下面公式计算不同药物浓度时细胞存活率.

细胞存活率(%)=(试验孔D值/对照孔D值)×100%

1.5 沙冬青总黄酮体外抗BPIV-3试验

在安全浓度基础上将沙冬青总黄酮倍比稀释成8个稀释度，取用100TCID50的BPIV-3病毒液0.1 mL感染MDBK细胞，设不同的实验组，包括细胞对照组、病毒对照组和沙冬青总黄酮组(8个浓度组).采用96孔细胞培养板，每一浓度8孔.试验采用3种给药方式：药物对BPIV-3的直接作用：将病毒和药物同时加入MDBK细胞中；药物对BPIV-3的阻断作用：先将药物加入MDBK细胞中37 ℃培养6 h后，再接种病毒；药物对BPIV-3复制的抑制作用：先将病毒感染MDBK细胞37 ℃培养2.5 h后，再加入不同浓度的药物.上述各组细胞置于37 ℃、50 mL/L CO2恒温培养箱中培养，每日观察CPE情况，当病毒对照组CPE达到达到75%以上时，细胞对照组正常时，记录CPE情况.然后采用MTT比色法，测定570 nm处的D值，并计算药物对BVDV病毒的病毒抑制率.试验重复3次.

病毒抑制率(%)=

1.6 数据处理

2 结果

2.1 TCID50的测定结果

由表1按Reed-Muench氏法计算，BPIV-3在MDBK细胞中的TCID50为10-7.733/0.1 mL.既将该病毒稀释10-7.733接种100 μL可使50%的MDBK细胞发生病变.

表1 BPIV-3半数细胞感染剂量(TCID50)Tab.1 The TCID50 of BPIV-3

2.2 沙冬青总黄酮对MDBK细胞的毒性试验结果

由表2可知，沙冬青种子总黄酮对MDBK作用在当药物浓度达到0.187 mg/mL时，细胞存活率达到了104.27%，细胞存活率超过了100%，表明对MDBK无不良影响，CPE观察也显示与对照组细胞无明显差异，表明沙冬青总黄酮低于0.187 mg/mL对MDBK无毒性作用.因此，沙冬青种子总黄酮的安全浓度为0.187 mg/mL.

2.3 沙冬青总黄酮对BPIV-3作用结果

2.3.1 沙冬青总黄酮对BPIV-3的直接杀灭作用 由表3可知，沙冬青总黄酮对BPIV-3的直接杀灭作用效果明显.试验所设沙冬青总黄酮的8个浓度组对BPIV-3都有一定的一直杀灭作用，且随着作用浓度的增大杀灭效果逐渐增强，当浓度为0.187 mg/mL时BPIV-3抑制率达89.43%，细胞存活率高达96.66%，其D570值与细胞对照比差异不显著(P>0.05)，在显微镜下，MDBK病变程度比病毒对照组明显减轻.说明沙冬青总黄酮对BPIV-3具有良好的直接灭活效果.

表2 沙冬青种子总黄酮对MDBK细胞存活的影响

Tab.2 The effect of total flavonoid ofAmmopiptanthuson MDBK survival rate

重复孔数药量/(mg·mL-1)D570nm细胞存活率/%8120.0828.74860.11612.37830.15616.6381.5000.19720.9180.7500.50553.8480.3750.77382.4180.1870.978104.2780.0930.982104.688细胞对照0.937

表3 沙冬青总黄酮对BPIV-3的抑制作用

Tab.3 The inhibition of total Flavonoid fromAmmopiptanthuson BPIV-3

处理药量/(mg·mL-1)重复孔数直接作用D570nm细胞存活率/%病毒抑制率/%阻断作用D570nm细胞存活率/%病毒抑制率/%抑制作用D570nm细胞存活率/%病毒抑制率/%10.18780.52396.6689.440.44186.9868.360.38078.8150.5520.09480.49190.4269.870.409*80.5152.580.352*72.6236.1130.05080.44782.6245.170.372*73.3735.270.332*68.6926.9340.02580.438*80.6738.960.370**72,9034.100.324*67.1123.2550.01280.430*79.2534.410.360**71.0229.480.307**63.4814.7960.00680.422**77.6929.460.349**68.8724.270.294**60.938.7670.00380.421**77,4528.690.346**68.2222.710.290**60.026.7080.00280.413**76.0224.200.333**65.4816.050.286**59.194.77病毒对照80.3710.2990.276细胞对照80.5440.5070.483

与细胞对照组比较，未标记表示差异不显著(P>0.05)， *表示差异显著(P<0.05)，**表示差异极显著(P<0.01).

2.3.2 沙冬青总黄酮对BPIV-3的阻断作用 由表3可知，沙冬青总黄酮对BPIV-3的阻断作用也较明显.沙冬青总黄酮的8个浓度对BPIV-3均具有一定的阻断抑制作用，且随着沙冬青总黄酮浓度的增大阻断作用效果也逐渐增强，当浓度为0.187 mg/mL时对BPIV-3阻断抑制率达68.36%，而细胞存活率达到86.98%，其D570值与细胞对照比差异不显著(P>0.05)，在显微镜下，MDBK病变程度也比病毒对照组有较明显的减轻.表明沙冬青总黄酮能有效阻断BPIV-3对细胞的侵入，具有较好的预防感染作用.

2.3.3 沙冬青总黄酮对BPIV-3的抑制作用 由表3可知，沙冬青总黄酮8个浓度组对BPIV-3复制都有一定的抑制作用，且随着沙冬青总黄酮浓度的增大作用复制抑制效果也不断增强.当浓度为0.187 mg/mL时对BPIV-3复制抑制效果最明显，达到50.55%，而细胞存活率达到78.81%，其D570值与细胞对照比差异不显著(P>0.05)，在显微镜下，MDBK病变程度与病毒对照组比较也有减轻.表明沙冬青总黄酮也能有效抑制BPIV-3复制.

3 讨论

本研究首次证明沙冬总青总黄酮具有明显抑制BPIV-3增殖和减轻BPIV-3病毒感染引起MDBK细胞的CPE病变程度.研究结果表明，沙冬青总黄酮在安全浓度范围内，对BPIV-3的抑制率与的作用浓度之间呈一定的量效关系.在不同的给药方式和不同的药物剂量组中，沙冬青总黄酮均表现出程度不等的抗BPIV-3作用，对BPIV-3感染MDBK细胞具有不同程度的抑制，尤其在直接作用试验中，当沙冬青总黄酮浓度为0.187 mg/mL时，对BPIV-3病毒感染MDBK细胞的抑制率高达89.44%(P<0.05)，显示沙冬青总黄酮具备良好的抗BPIV-3病毒特性.由于沙冬青总黄酮对BPIV-3的抑制作用与其作用剂量有一定依赖性，因此，可适当提高沙冬青总黄酮的作用剂量来增强其抗BPIV-3的活性.

从沙冬青总黄酮对BPIV-3病毒直接杀灭作用、阻断作用和抑制作用来看，其直接杀灭BPIV-3病毒的效力要明显强于抑制BPIV-3病毒在细胞内进行生物合成以及预防BPIV-3病毒吸附于细胞的能力.因此，沙冬青总黄酮对BPIV-3病毒的主要抑制来自对BPIV-3的直接杀灭作用，同时也具有一定预防BPIV-3病毒入侵细胞或在细胞内进行相关生物合成的作用.本研究也表明，沙冬青总黄酮在对BPIV-3直接杀灭作用中对BPIV-3病毒感染的MDBK细胞具有明显的保护作用，细胞存活率明显提高，而在阻断作用和抑制作用中，这种保护作用不如直接杀灭作用明显，推测可能因沙冬青总黄酮对在细胞内正在复制扩增的BPIV-3病毒抑制作用较弱或因沙冬青总黄酮作用时间不足导致细胞未能完全吸收所致，具体机制尚待深入研究.

本研究利用CPE观察和MTT比色法检测沙冬青总黄酮对MDBK细胞毒性试验表明，在安全作用剂量范围内，当沙冬青总黄酮作用剂量降低到一定范围时，与对照组比较不仅对MDBK细胞没有毒性，而且还具有明显促进MDBK细胞增殖的作用，表现出使培养MDBK细胞生长状况更好，细胞层明显加厚，具有明显促进MDBK细胞增殖的作用.因此，沙冬青总黄酮也可成为MDBK细胞保护剂.

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(责任编辑 李辛)

Effect of the total flavonoid ofAmmopiptanthusmongolicaon BPIV-3invitro

ZHANG Jia-nan,TAO Bo,HUANG Zhi-hao ,FANG Mei ,JIA Ning

(College of Veterinary Medicine,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China)

【Objective】 To study the anti-viral effect of the total flavonoid ofAmmopiptanthusmongolicaagainst BPIV-3 virus in vitro and its antiviral mechanism.【Method】 Cell survival rate and inhibition rate were used as index to evaluate antiviral activity of the total flavonoid ofA.mongolicaby MTT.Cell survival rate and inhibition rate were measured by three administration ways of infecting virus-and-applying hypericin,inoculating virus-after-applying hypericin,infecting virus before applying hypericin,respectively.【Result】 The results showed that safe concentration of total flavonoid ofA.mongolicawas 0.187 mg/mL,BPIV-3TCID50was 10-7.733/0.1 mL,within the concentration it had good inhibition effect on the replication of BPIV-3 and showed certain dose-effect.Compared with the virus control group,at the concentration of 0.187 mg/mL,BPIV-3 inhibition rate reached 89.43%,cell viability up to 96.66%.At the concentration of 0.187 mg /mL,blocking inhibition rate reached 68.36% and cell survival rate was 86.98%.At the concentration of 0.187 mg/mL,replication inhibiting effect on BPIV-3 was most obvious reaching 50.55% and cell survival rate 78.81%.The effect of direct killing on BPIV-3 was better than blocking and inhibiting effect.【Conclusion】 The total flavonoid ofA.mongolicahas obvious effect against BPIV-3 virusinvitro.

total flavonoid ofAmmopiptanthusmongolica;antiviral effect;BPIV-3 virus;invitrotest

张嘉男(1990-)，男，硕士研究生，主要从事动物病理学及新兽药研发.E-mail：623409818@qq.com

贾宁，男，教授，博士，主要从事动物疾病病理与免疫病理学研究.E-mail：jianing@gansu.edu.cn

国家自然科学基金(31560686)项目.

2015-12-08；

2016-03-28

S 853.75

A

1003-4315(2016)06-0006-05