分子技术在临床微生物检验中的应用

2016-02-05李美丽

中国卫生标准管理 2016年9期

李美丽

分子技术在临床微生物检验中的应用

李美丽

【摘要】随着分子技术在现代社会的广泛应用，微生物检验逐渐提高到了一个新的水平，分子技术已逐渐成为临床诊断的主要依据。作为一门实践性较强的学科，临床微生物要求微生物检验人员理论与实践相结合，结合临床实践。文章简要介绍了分子技术在微生物检验中的应用，主要包括PCR技术、核酸探针技术、基因芯片技术和其它相关的分子技术在微生物检验中的应用，使得分子技术在临床微生物检验中发挥最大的作用，更好的应用于临床。

【关键词】分子技术；微生物检验；聚合酶链反应；核酸

With the wide application of molecular techniques in modern society，microbiological testing is gradually raised to a new level，molecular technology has gradually become the main basis for clinical diagnosis. As a practical strong discipline，clinical microbiology requires inspectors to combine theory with practice. This article briefly describes the application of molecular techniques in microbiological testing，including PCR technology，nucleic acid probes，gene chip technology and other related molecular techniques in microbial testing of such molecular techniques to maximize the clinical microbiological testing of action，better clinical application.

【Key words】Molecular techniques，Microbiology inspection，Plolymerase chain reaction，Nucleic acid

作为21世纪的主导技术之一，分子技术发展越来越迅速，且更广泛地应用于微生物检验，使得一些病原微生物能从RNA、DNA的水平上检测出来，这就在一定程度上减轻了医务工作者的负担。聚合酶链反应（plolymerase chain reaction，PCR）技术，能对病毒基因进行快速诊断、对病原微生物进行鉴定，同时，在筛查肿瘤方面也较好，因此得到了广泛的推广运用［1］。核酸探针技术比较广泛用于病原菌检测，又快又敏感，且精准［2］。基因芯片技术能快速检测多种待检产品，信息量相对较大，通量也相对较高，因此对于病原菌的检测具有独特优势。通常的传统微生物检验技术，主要根据微生物存在状态进行分类。由于同一种生物在其生理生化性状及形态都存在差异，这些方法存在一定误差，因此很难准确鉴定。现如今，由于其迅速发展的速度，分子技术已经广被接受，且越来越多通过一些研究，将微生物放在核酸水平上进行考虑，并对其结果进行鉴定。其鉴定结果更具备说服力，究其原因，是因为分子技术具有与其它不同的特点，包括快速、简便、可靠、高效，而这些传统的微生物检验方法不具备此特点。现在探讨核酸探针、PCR及基因芯片等分子技术在微生物检验中的最新应用研究，从而为相关研究奠定基础。

1　PCR技术

PCR，即聚合酶链式反应，是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，其最大特点，是能大幅增加微量的DNA。因此，无论是凶杀案中凶手所遗留的皮肤、毛发或血液，或是历史人物的残骸、化石中的古生物，只要能分离出相对较少的DNA，就能用PCR加以放大，进行比对。这也是“微量证据”的威力之所在。PCR的设想最初是由美国Mullis在1983年首次提出，随着1985年聚合酶链反应的问世，即简易DNA扩增法，意味着PCR技术的真正诞生。到2013年，PCR已发展到第三代技术。1973年，台籍科学家钱嘉韵，发现了稳定的Taq DNA聚合酶，为PCR技术发展也做出了基础性贡献。

PCR作为一种新兴的分子技术，兼具应用广、发展快、生命力强大等特点，通过进一步的研究，研究人员逐渐推导出聚合酶链式反应技术的特性和原理，并经过多年的发展，使得该技术得到进一步完善。不仅如此，研究学者经过长时间的研究，发掘出其它的相关用途，比如，连接酶链反应是依赖核酸序列的扩增、转录依赖扩增系统以及免疫PCR等［3］。随着时间的发展，到了20世纪末，我国便已经开始将PCR技术应用在病原微生物检验中，如检验获得免疫性病毒、性病致病菌、肝炎病毒等［4］。

虽然PCR技术比较先进，但也存在一些问题，比如形成引物二聚体、出现假阳性、RNA病毒的PCR检测操作繁琐等。这些问题的出现，让更多专家学者不得不再次对其进行研究，为了弥补其不足，通过不断的研究，一些新的PCR技术逐渐衍生出来并被用于实践，如巢式PCR、热启动PCR、限制性长度多态性分析（RFLP）、通用引物PCR、随机引物DNA 多态性扩增（RAPD）、多重PCR、逆转录PCR、实时荧光PCR（real-time PCR）等［5］。

综上所述，PCR技术尽管会有缺点，但将来仍有可能改变微生物检验的发展，这种发展，不再仅仅局限于生理特性及外部形态结构，而是让微生物检验发展成为分子水平以上的确诊。

2　核酸探针技术

所谓核酸探针，主要是指带有标记的特异DNA片段，通过一些固定的原则（如碱基互补配对），让其与目的DNA进行杂交，最后再用特定的方法测定标记物［4］。常见的探针标记的方式主要有非放射性标记及放射性标记，而前者目前应用较多，较为准确与直观［6］。例如，生物素-抗生物素蛋白系统标记的探针目前的应用越来越受到广大研究学者的欢迎，已在一些相应的检测中得到了应用，主要的检测指标包括乙型肝炎病毒、产肠毒素大肠杆菌以及沙门氏菌的检测［7］。

现如今，核酸探针在微生物检验领域的应用，主要包括：（1）用于流行病学调查研究，区分无毒及有毒菌株；（2）用于检测不能进行生化鉴定、无法培养、以及缺乏诊断抗原等病原体的检测；（3）检测细菌内之间的抗药基因；（4）用于检测病毒病，如检测获得免疫性缺陷病毒、肝炎病毒；（5）用于分析食品是否会被某些耐药菌株污染，判定食品污染的特性。相关学者以啤酒腐败菌中厌氧菌Pectinatus的16SrRNA作为靶分子设计寡核苷酸探针，利用荧光标记检测啤酒是否发生污染。

3　生物芯片技术

生物芯片技术是20世纪90年代中期以来最具影响的学科之一，作为融合多种尖端科学（生物学、微电子学、计算机科学等）的技术。生物芯片技术主要以玻片为载体，以生物活性分子为排列序列，经过排列组合，可以起到同时检验多种疾病的目的。基于其准确高效的特点，基因芯片技术现如今已逐渐运用到有关基因系列，且越来越多地被运用到病原菌感染的研究中［8］。

基因芯片技术具有如下优势：首先，基因芯片技术检验特性更加准确，通过各种不同的方法，可将其它方法检验不出的一些问题检验出来，时效性较高，已经广泛运用于基因序列的分析、病原微生物感染的快速诊断、病原菌变异及耐药机制的研究。其次，基因芯片技术具有检验抗体产生之前的感染的特性，因此针对有无感染的情况，通过检验便知。同时，基因芯片技术具有更高效的检验特性，能够直接且快速地确定病原体的类型。传统的检测技术无法有效获得患者的精确信息，因此医生会由于诸类原因而无法有效的进行治疗［9］。随着医疗技术及基因芯片技术的不断完善和发展，在不久的姜磊众多的微生物全基因序列将得到测定，人们或许能在一张芯片上检测出所有的病原菌。

4　其它分子技术

除上述分子技术，随着分子技术的发展，越来越多的分子技术孕育而生。DNA分子标记技术、ATP生物发光法、气相色谱法、高效液相色谱法等，让微生物检验得到了更高的精准度与效率。目前，分子技术的发展方向主要集中于高度自动化、高度特异性及高度灵敏性［8］，使得各个技术之间的局限被打破，且能更好与其它学科进行交叉并融合，从而将检验的范围扩展；同时，随着新分子技术的不断孕育，分子技术在微生物检验中的应用也随之变得越来越广泛［10］。

5　结语

综上所述，分子技术在微生物检验中的运用变得逐渐广泛，现在分子技术的种类不断增加，各个方法之间，有优势，也有不足。在实际的临床应用中，要想鉴定一个新的菌株，除了利用不同分子技术外，还要综合各项鉴定结果，系统地从生理生化特征等方面逐一进行鉴定，才能更好的确定菌株的分类与归属。分子技术能提高临床微生物检验的精准度，提高检验效率。

参考文献

［1］路则宝，白现广. 分子生物学技术在微生物检验中的应用研究进展［J］. 红河学院学报，2013，11（2）：61-63.

［2］栗舒娅. 分子生物学技术在微生物检验中应用［J］. 大家健康（学术版），2016，10（9）：60-61.

［3］王治国. 微生物检验在临床应用中的质量控制［J］. 当代医学，2014，20（7）：147-148.

［4］何惠珍. 现代分子生物学技术在微生物检验中的应用［J］. 生物技术世界，2016（2）：319.

［5］张冬民. 分子生物学技术在微生物检验中的应用研究［J］. 中国保健营养（下旬刊），2014，24（7）：4385.

［6］邱浩然，赵霞，王晓春，等. 现代分子生物学技术在活性污泥微生物菌群多样性研究中的应用［J］. 四川环境，2013，32（6）：129-132.

［7］倪语星. 关注分子技术在临床微生物检验中的应用［J］. 检验医学，2014，29（6）：581-583.

［8］王海英. 分子生物学技术在医学检验中的应用进展［J］. 当代医学，2011，17（6）：16.

［9］周昭彦，胡必杰，鲍容，等. MALDI-TOF质谱快速鉴定非结核分枝杆菌方法的建立和评价［J］. 中华检验医学杂志，2013，36 （7）：610-614.

［10］戴颖欣，李敏. MALDI-TOF MS在临床微生物检验中的应用［J］.检验医学，2015，30（2）：102-107.

Application of Molecular Techniques in Clinical Microbiology Inspection