婴儿配方粉中克罗诺杆菌属菌株的分子溯源技术

陈万义，刘振民，任 婧

（光明乳业股份有限公司光明乳业研究院，乳业生物技术国家重点实验室，上海200436）

婴儿配方粉中克罗诺杆菌属菌株的分子溯源技术

陈万义，刘振民，任 婧

（光明乳业股份有限公司光明乳业研究院，乳业生物技术国家重点实验室，上海200436）

克罗诺杆菌属菌株水平上的快速准确的鉴定和区分对于控制由该属引起的食源性疾病的监控、预防和控制具有十分重要的意义。同时，对于分子流行病学的研究也是至关重要的。越来越多的基因分型方法已经被用于克罗诺杆菌属内菌株的分子分型。为了切断克罗诺杆菌属菌株的传播途径和快速确定感染源，本综述主要针对目前克罗诺杆菌属菌株的分子分型方法进行了较为详细的探讨。简要介绍了克罗诺杆菌属分子分型方法的最新研究进展，以便发生乳粉污染克罗诺杆菌属菌株时能够快速溯源，防止食物中毒事件的进一步蔓延。

克罗诺杆菌属；鉴定；分子分型

0 引言

克罗诺杆菌属（原阪崎肠杆菌）是人和动物肠道内寄生的一种革兰阴性无芽孢杆菌。直至1980年，其被鉴定命名为阪崎肠杆菌（Enterbacter sakazakii），归属于肠杆菌科肠杆菌属，并包括15个生物型［1］。2012年，Joseph等［2-4］根据多序列比对分析（Multilocus Sequence Typing）将克罗诺杆菌属分成7个种，分别是阪崎克罗诺杆菌（C.sakazakii），丙二酸盐克罗诺杆菌（C.malonaticus），苏黎世克罗诺杆菌（C.turicensis），穆汀斯克罗诺杆菌（C.muytjensii），都柏林克罗诺杆菌（C.dublinensis），尤尼沃斯克罗诺杆（C.universalis），康帝蒙提克罗诺杆菌（C.condimenti）［5-7］。

克罗诺杆菌属内7个种对化学物质的敏感性以及温度和抗生素方面存在较大的差异［8-10］，从而导致的致病力大小也不尽相同［11-13］。因此，采用分子溯源方法能够正确鉴定和快速区别不同来源的克罗诺杆菌属菌株。

1 分子溯源方法

1.1 血清学分型

存在于革兰氏阴性细菌外膜中的脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）的一部分为其O抗原的组成成分，而且是细胞壁中最易产生变化的组分之一［14］。革兰氏阴性细菌该部位物质的结构变化构成了血清学分型的理论基础。由于阪崎克罗诺杆菌特异的血清型和婴儿肠炎的发生有着直接的相关性，因此鉴定阪崎克罗诺杆菌的血清型对于流行病学调查一直被广泛应用。2008年Mullane et al根据基因weh设计引物去鉴定阪崎克罗诺杆菌的抗原O1和O2［15］。2012年，在前人的研究基础上，南开大学的王磊教授系统研究了阪崎克罗诺杆菌的0抗原基因簇［16］，完善了阪崎克罗诺杆菌7种O抗原的PCR鉴定方法。

1.2 脉冲场凝胶电泳

脉冲场凝胶电泳（Pulsed-Field Gel Electrophoresis，PFGE）是一种非扩增的基于对细菌全基因组酶切后通过脉冲场电泳将酶切后的分子量大小不一的DNA片段（一般大于15～20 kb）进行分离。它的原理为：细菌包埋于琼脂块中，用适当的内切酶在原位对整个细菌染色体进行酶切，酶切片段在特定的电泳系统中通过电场方向不断交替变换及合适的脉冲时间等条件下而得到良好的分离。

早在1994年PFGE技术就已经应用到阪崎克罗诺杆菌的分型研究中［17］。法国疾病预防控制中心的医生从17个婴幼儿的体内、食用过的食物和未食用过的配方粉中分离到了克洛诺杆菌属菌株。利用PFGE对这17株分离菌株进行分型，经聚类分析后分型为4个群，其中有两个群包含的分离菌株是从患病婴儿体内分离得到的，其中一个群包含的分离菌株分离于症状轻微的婴儿，而另一个群的分离菌株分离于意外死亡的婴儿。第三个类型包含的分离菌株是从准备的食物，一个无明显症状的婴儿和一个肠道具有轻微消化问题的婴儿。第四个群中含有的分离菌株全部都是从婴幼儿配方粉中分离得到的。在这个实例中，发现这起食物中毒事件和婴幼儿配方粉并没有直接的内在联系，而是由准备喂养的其他食物通过其他途径感染阪崎克洛诺杆菌属菌株造成的［18］。

PFGE分型的优点是：特异性高，重复性好，分辨率高，结果可靠，是监测食源性病原菌暴发流行的极其有用的手段之一，能较好地反映出受试菌的流行病学相关性，有效追查传染源，发现传播方式，及时控制疾病的暴发流行，指导临床治疗，快速、可靠、准确地用于医院感染暴发病原体的分子流行病学调查，是医院感染调查最好的分型方法。其缺点是：技术复杂、耗时、费用高，需要特殊的仪器设备。另外就是经常有菌株难以进行PFGE分型，切切不利于快速分型，这也从某种程度上消弱或限制了它的应用。

1.3 核糖体分型

核糖体是细胞内一种核糖核蛋白颗粒（ribonueleoprotein particle），在各类细胞中普遍存在的颗粒状结构，是一种非常重要的细胞器。核糖体是无膜的细胞器，主要成分是蛋白质与RNA。核糖体RNA简称为rRNA，约占60%，蛋白质约占40%，蛋白质分子主要分布在核糖体的表面，而rRNA则位于内部，二者靠非共价键结合在一起。其中rRNA在细菌的长期进化过程中变化不大，这表现在碱基组成、碱基序列、高级结构及功能等不同层次的保守性。如果能选择一个相对可变且又保守的目标序列将会有利于其广泛开展.核糖体分型对研究环境分离菌株与感染病人之间的潜在的联系有很大的帮助。核糖体分型是一种DNA限制性内切酶分析与Southern杂交技术相结合的方法。它是利用Southern印迹技术来检测含有rRNA基因的染色体区域的多态性，探针序列和标记技术可以不同，最常用的探针序列为大肠埃希菌16S和23S rRNA片段。rRNA是细菌进化过程中高度保守的基因，可用一个探针分型许多细菌。阪崎克罗诺杆菌染色体DNA经限制酶切消化后，经琼脂糖凝胶电泳分离，然后与细菌rRNA探针杂交，根据杂交条带的数目和大小不同鉴别菌株。尽管它的实用性、描述能力不及PFGE和RAPD法，但当对大量的菌株进行评估的时候用核糖体分型往往是更好的筛选方法。有报道表明，核糖体分型作为一种新型的检测分类方法，可以用来进行副溶血弧菌分子流行病学调查的手段。杜邦RiboPrinter全自动微生物基因指纹鉴定系统已经被成功地应用于克罗诺杆菌属的多态性分类鉴定。

Nazarowec-White和Farber［19］于1999年对某一家医院11年里分离到的3株克罗诺杆菌属分离菌株进行了核糖体分型，发现他们的分型图谱是一致的，表明环境中存在的克罗诺杆菌属致病菌株具有高度的遗传相似性。因此，说明核糖体分型能够用于区分不同来源的克罗诺杆菌属菌株之间的相关性，是一种相对快速简便的分型方法。该方法的优点是分型率高，分辨力强，重复性好，结果判定容易，现在已有商品化的核糖体分型自动系统。缺点是技术复杂，费用较高，难以普及。另外核糖体分型由于其是基于非常保守的基因，因此，相对于其他分型方法分辨能力略低一些。

1.4 REP-PCR和ERIC-PCR

肠杆菌科基因间重复序列为引物的聚合酶链式反应（enterobacterial repetitive intergenic consensus PCR，ERIC-PCR）分型技术，是以肠杆菌科基因间重复序列为引物进行PCR，能扩增出多态性的DNA图谱。由于这些短重复序列在菌株种属水平上分布有差异以及进化过程有相对保守性，通过比较DNA图谱既可对各种微生物进行快速分型及鉴定，又可对其进行DNA水平上的遗传多样性分析。在ERIC的中心有一段保守性很高的反向重复序列，该序列长约44 bp，Versalovic［20］根据这一ERIC核心序列设计了反向引物，用于扩增两段ERIC之间的片段，发展出了ERIC-PCR技术。同样根据基因外重复回文系列（REP）设计引物扩增两段REP之间的片段，发展出了REP-PCR技术。

目前，ERIC-PCR技术已经广泛应用于检测各种革兰氏阴性菌。2008年，Proudy［21］利用ERIC-PCR、PFGE以及鞭毛基因fliC的序列测定三种分型方法分析了27株克罗诺杆菌属临床分离株和环境分离株。结果表明ERIC-PCR和PFGE分型的结果达到了92%的一致性，说明ERIC-PCR方法能够用于克罗诺杆菌属菌株的流行病学调查的研究。单单依靠鞭毛基因fliC的序列进行区分，其分辨率相对较低，难以满足流行病学调查的要求。此外，Heaty［22］利用REP-PCR和PFGE同时对克罗诺杆菌属分离菌株进行了分子分型的比较，通过计算辛普森指数，发现PFGE的分辨率是0.998，而REP-PCR的分辨率是0.974，表明两种方法之间的分辨率差别不大。尽管PFGE是致病菌株流行病学调查的“金标准”，然而基于PCR的分子分型方法却更加经济、操作简便并且能够更快的获知结果。

1.5 随机扩增多态性分析（RAPD）

随机扩增多态性DNA分析（random amplified polymorphic DNA，RAPD）技术是建立在PCR基础之上的一种可对整个未知序列的基因组进行多态性分析的分子技术。其以基因组DNA为模板，以单个人工合成的随机多态核苷酸序列为引物，在热稳定的DNA Taq聚合酶作用下，进行PCR扩增。扩增产物经琼脂糖或聚丙烯酞胺电泳分离、溴化乙锭染色后，在紫外透视仪上检测多态性。扩增产物的多态性反映了基因组的多态性。RAPD技术已经广泛的应用于生物的品种鉴定、系谱分析及进化关系的研究上。

早在1999年，Nazarowec-White和Farber就开发了对克罗诺杆菌属菌株进行分子分型的方法［19］，他们采用了RAPD、核糖体分型和PFGE同时对克罗诺杆菌属菌株进行了分子分型。和核糖体分型，生物型以及抗菌图谱的分型结果相比，RAPD和PFGE是分辨率最高的两种分型方法。虽然RAPD的分型结果在不同实验室间变化较大，分辨力也不如PFGE技术高；但在疾病暴发流行时，RAPD仍是一种分析相关菌株和排除不相关菌株的良好技术。该方法的优点是快速、简便、安全、灵敏、经济，引物通用，不必预先知道待扩增序列，适用于医院感染的监控研究、细菌遗传学和流行病学研究及细菌基因型和各种表现型关系的研究。缺点是用单一引物分辨率低。虽然随着引物的增加分辨率增高，但操作技术也更复杂，并易受所选择引物、反应控制条件（如模板质量、Mg2+浓度、引物浓度）等因素的影响。

1.6 扩增片段长度多态性

扩增片段长度多态性（Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP）技术是基于PCR反应的一种选择性扩增限制性片段的方法。由于不同物种的基因组DNA大小不同，基因组DNA经限制性内切酶酶切后，产生分子量大小不同的限制性片段。使用特定的双链接头与酶切DNA片段连接作为扩增反应的模板，用含有选择性碱基的引物对模板DNA进行扩增，选择性碱基的种类、数目和顺序决定了扩增片段的特殊性，只有那些限制性位点侧翼的核苷酸与引物的选择性碱基相匹配的限制性片段才可被扩增。扩增产物经放射性同位素标记、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后根据凝胶上DNA指纹的有无来检验多态性。

2007年，Iversen等［2］利用该技术对200余株克罗诺杆菌属菌株进行了分型，和DNA-DNA杂交相比，该技术具有更高的分辨率和更强的多态性。缺点是操作步骤繁琐，费时费力。

1.7 多位点可变重复序列分型

多位点可变重复序列（Multiple-locus variable-number tandem repeats，MLVA）是一种新出现的分子指纹图谱技术，已经被应用到大肠杆菌O157：H7和金黄色葡萄球菌等食源性致病菌的种间鉴定和分型中。其原理是根据细菌染色体上有多个较短且重复数目不同的核酸片段，不用菌株之间在不同位点的重复数目并不完全一致，因此可以在目标序列两端设计引物，PCR扩增后对扩增产物进行测序或通过毛细管电泳分离分析，即可比较不同菌株之间的序列差异，从而可以鉴定它们的基因型是否一致。通过序列重复查找软件trf或网上数据库（http://genome/wustl. edu/pub/organism/Microbes/Enteric_Bacteria/Enterobacter_sakazakii/assembly/Enterobacter_sakazakii-4.0/））即可发现阪崎克罗诺杆菌两条染色体上的所有VNTR（variable-number tandem repeats），通过筛选比较即可进行引物的设计。Mullane et al等［23］已经根据该原理建立了克罗诺杆菌属菌株的多位点可变重复序列分型方法，并根据该方法对搜集到的不同来源和不同表型的克罗诺杆菌属菌株进行了分型。

该方法的优点是：简单、快速，分辨率高，重复性好，没有先进电泳设备的实验室也可进行。在相关菌株的分型中，该法比PFGE分型、噬菌体分型的分辨力更高］。MLVA技术日趋成熟，能进行国际化比较，适合基层应用及全球流行病学研究，有效地追踪暴发和其他形式的细菌播散，并可进行大样本的检测分析。其缺点是：作为带型分型方法输出结果有局限性，而且不方便对每个位点重复序列的数目进行计。

1.8 多位点序列比对分型

多位点序列分析（Multilocus sequence typing，MLST）是一种基于看家基因序列之间的突变位点之间的差异进行分型。首先选定目的基因组的数个管家基因位点，对各基因位点设计相应的PCR扩增引物，然后扩增各自的管家基因片段。扩增的产物纯化后测定各位点片段的DNA序列，进而给出每个基因位点指定相应的等位基因数值。各管家基因位点的等位基因数值共同构成一个等位基因谱，从而命名相应的序列型。Joseph et al［24］根据7个看家基因（atpD，fusA，glnS，gltB，gyrB，infB和ppsA；全长3，036 bp）分析了克罗诺杆菌属325株菌株的多态性关系，研究结果发现阪崎克罗诺杆菌（ST4）是导致婴儿脑膜炎最主要的基因型。

该方法的优点是重复性好，二期建立了有大型数据库的国际网站，可直接将试验结果提交数据库进行比较，为食源性病原菌流行病学研究提供巨大的信息资源，并可分析菌株的遗传相关性。此外，该法适合长期大范围的流行病学调查（如全球流行病学调查），探测菌株的起源和进化；缺点是工作量大，费用高，需要核酸测序技术，技术要求严格，需特殊仪器设备，不适合暴发流行的常规调查和全球流行病学水平的监督。

2 结束语

克罗诺杆菌属菌株是污染婴幼儿配方粉的一种危害较大的食源性致病菌.运用传统的细菌培养法每次只能确定或排除一种病菌，而且费时费力，难以实现对病原菌的危急确认；而且由于病原菌血清型和致病性不存在对应的关系，因此单独的血清学分型方法难以准确分析菌株之间的亲缘关系。因此对出现和暴露的污染问题，不能进行全面的溯源和追踪分析，因而找不到或无法证实感染的根源，往往延误疾病的治疗和流行的控制，这也是长期以来制约快速处理急性中毒事件的瓶颈和困扰卫生监督和防疫部门的难题所在。因此，正确鉴定、分类和追溯克罗诺杆菌属菌株的传染源成为当务之急十分迫切的一项科研任务。分子分型方法已经在食源性病原菌毒力菌株和流行致病菌株的鉴定和溯源方面发挥了无可比拟的优势，它不但可以追踪食源性病原菌流行株的感染源，还可以快速确证不同地区不同变种之间的差异，从而能够快速正确地确定致病菌的源头，立即启动召回措施，切断传播途径，从而防止危害的进一步传播和蔓延。

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Research progress on the molecular typing of Cronobacter spp.from powder infant formula

CHEN Wan-yi，LIU Zhen-min，REN Jing
（State Key Laboratory of Dairy Biotechnology，Dairy research institute，Bright Dairy&Food Co.，Ltd.，Shanghai 200436，China）

Rapid and reliable identification of strains of the genus Cronobacter is important for surveillance，prevention and control of this food-borne pathogen.Moreover，for Cronobacter a species differentiation is relevant for epidemiological studies.At present，more and more genotyping methods have been used to differentiate Cronobacter spp..This review summarizes the latest molecular typing methods for detection，identification and typing of Cronobacter spp..Therefore，we can take measures to rapidly find out the source of produce and prevent the spread of food poisoning events once powdered infant formula（PIF）is contaminated by Cronobacter spp..

Cronobacter spp；identification；molecular typing

Q935

B

1001-2230（2016）08-0043-04

2015-11-27

上海市经委引进技术的吸收与创新计划（14XI-1-15）；科技部农业科技成果转化资金（2012GB2CO00141）。

陈万义（1975-），男，高级工程师，研究方向为食品安全。

任婧