siRNA技术诱导基因沉默在骨科疾病中的研究进展

农　峰，蓝常贡(审校)，廖林波

(右江民族医学院附属医院脊柱骨病外科，百色，533000)



文献综述

siRNA技术诱导基因沉默在骨科疾病中的研究进展

农峰，蓝常贡(审校)▲，廖林波

(右江民族医学院附属医院脊柱骨病外科，百色，533000)

【关键词】RNAi；siRNA；基因；骨科疾病

自从1998年Fire等[1]证实Guo等[2]发现的正义RNA抑制同源基因表达的现象为RNA干扰(RNA interference，RNAi)以来，RNAi技术经历了一个迅速发展的过程。RNAi技术是利用双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)降解细胞内同源信使RNA(messenger RNA,mRNA)，从而阻断特定基因表达，使细胞出现靶基因缺失的表型[3]，具有高效、特异地沉默目的基因的特点[4]，其种类包括：小干扰RNA(Small Interfering RNAs,siRNA)、微小RNA(Micro RNAs，miRNA)和短发夹RNA(Short Hairpin RNAs,shRNA)。目前，RNAi技术已被视为分子医学领域的一个重大突破。基于RNAi技术的性质特点及作用，其已被广泛应用于肿瘤[5]、抗病毒[6]以及遗传性疾病[7]等研究中。尽管RNAi技术用于骨科疾病的研究尚处于初步阶段，但已经取得了一定的进步。笔者就近年来siRNA技术诱导基因沉默在相关骨科疾病(比如骨关节炎、骨肉瘤、骨质疏松症和股骨头缺血性坏死)应用方面的研究作一综述。

1siRNA 技术在骨关节炎中的应用

骨关节炎(Osteoarthritis,OA)是一种最常见的慢性骨关节疾病，可引起患者的关节活动受限。随着年龄的增长，OA的发病率会逐渐增加。然而，OA在发生和发展过程中所涉及的确切分子机制尚未阐明。研究表明[8，9]，OA的病因是多因素的，包括遗传易感性、老化、肥胖、关节畸形或关节损伤等。针对严重OA的治疗，目前除了全关节置换手术外，尚未发现明显有效的干预措施来减缓OA的进展或延缓软骨的退化。随着基因工程技术的迅速发展，RNAi技术能靶向目的基因的表达。根据RNA干扰技术的独特性质，其已作为一种有效的工具，被广泛应用于OA的研究中。缺氧诱导因子-2α(hypoxia-inducible factor-2α,Hif-2α)是一种调节关节软骨代谢的因子，由EPAS1基因编码生成。最近的研究表明[10]，在OA患者中，Hif-2α呈现出显著的高表达状态，与Muraki等[11]研究结果相一致。这表明，Hif-2α在OA的发生及发展中可能扮演重要的作用。Pi等[12]通过膝关节前交叉韧带切除术(ACLT)构建小鼠骨关节炎模型，单纯向关节腔内注射携带Hif-2α siRNA的靶向软骨细胞纳米颗粒发现，siRNA可下调包括Hif-2α在内的多种代谢因子，并抑制降解酶的表达，阻碍关节软骨的退化。这与Jaffe[13]研究结果相吻合，从而初步表明Hif-2α是诱导关节软骨退变的重要因子。ADAMTS-5是蛋白多糖酶家族(ADAMTS)中的一员，与关节软骨退变程度呈正相关[14]。在体内试验和体外试验的研究中发现[15]，抑制ADAMTS-5的表达能明显减轻蛋白多糖的降解、丢失，从而起到保护软骨旳作用。这说明ADAMTS-5在OA的发病机制中可能发挥至关重要的作用。在鼠类骨关节炎模型的研究中发现[16]，通过向膝关节腔内单纯注射慢病毒载体介导的沉默ADAMTS-5基因的siRNA，可引起该基因表达下调，从而抑制关节软骨的退变。以上学者利用Hif-2α和ADAMTS-5对OA进行研究表明，这两种因子能影响OA发生的进程。但OA是否还存在其他重要基因需要进一步研究。因此，构建特异的siRNA抑制OA发生及发展相关细胞因子的表达，对OA的发生及发展有一定的抑制或延缓作用。

2siRNA技术在骨肉瘤中的应用

骨肉瘤(Osteosarcoma)是一种最常见的潜在广泛破坏性的原发性高度恶性骨肿瘤，其病因及相关发病机制尚未阐明。目前，骨肉瘤的治疗仅局限于手术及手术前后的化疗，虽然这种综合治疗方法在一定程度上能够改善骨肉瘤患者的状况，但仍未取得令人满意的长远效果。骨肉瘤仍然是目前致残率和死亡率较高的恶性骨肿瘤之一[17]。最近的报道表明，一些关键基因及分子在骨肉瘤的发生发展及分化的过程中起重要的作用，主要包括：脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1(AP endonuclease class I,APE-1)、分化抑制因子(Inhibitor of DNA differentiation,Id)、热休克蛋白75(Heat shock protein 75,HSP75)等。其中，作为恶性肿瘤之一的骨肉瘤，其发生与DNA修复相关酶的基因突变有密切关系，而APE-1为DNA修复相关酶的重要分子。因此，APE-1可能与骨肉瘤的发生密切相关。APE-1不仅能够修复DNA，而且还可以氧化还原DNA。基于APE-1这种功能，其可能有望成为治疗骨肉瘤的潜在靶点。DAI等[18]在研究转染了AEP-1-siRNA 质粒的骨肉瘤细胞HOS中发现，13个miRNA发生显著改变。其中，7个miRNA表达上调而其余6个miRNA表达下调。此外，该研究还发现，发生显著变化的13个miRNA及其靶基因参与骨肉瘤的发生发展，从而初步阐明AEP-1-siRNA可通过调节相关miRNA靶基因的表达来调控骨肉瘤的发生发展。Id因子又称DNA 结合抑制因子，是螺旋-环-螺旋转录调节因子家族中唯一具有抑制细胞分化、刺激细胞增殖的负性作用的因子。Id因子在多种肿瘤中的异常高表达已经得到研究者的广泛认可[19～21]。Id因子在骨肉瘤的形成中呈现出高表达状态[22]。因此，可通过下调Id因子的表达来抑制骨肉瘤细胞的增值。有学者[23]应用特异性针对小鼠 Id1 基因的小干扰 RNA 重组腺病毒(AdsimId1)感染骨肉瘤细胞K7M2-WT，进一步研究 Id1 基因沉默后对骨肉瘤细胞增殖的影响，并通过RT-PCR 及 Western Blot 的方法检测，结果显示重组腺病毒 AdsimId1 感染3 d 后 K7M2-WT 细胞 Id1 基因 mRNA 及蛋白水平的表达较非处理组明显降低，其增殖受到抑制。HSP75-siRNA能够显著降低骨肉瘤细胞HSP75蛋白的表达，明显抑制骨肉瘤细胞增殖和迁移[24]，表明沉默HSP75能有效抑制人骨肉瘤细胞的增殖和迁移。骨肉瘤的发生发展是多基因综合作用的结果，病理过程中既有抑癌基因又有促癌基因的作用。从骨肉瘤中发现更多抑癌基因并作为靶向治疗的靶点是目前骨肉瘤基因治疗的首选方向。因此，利用RNA干扰技术靶向目的基因的表达有望成为骨肉瘤治疗的新途径。

3siRNA技术在骨质疏松症的应用

骨质疏松症(Osteoporosis，OP)是以骨量减少，骨微环境受损及骨强度降低为特征，导致骨脆性增加、易发生骨折的全身性骨病[25]。随着全球老龄人口的增加和人均寿命的延长，OP的发病率也逐年上升。由于OP可使患者并发脆性骨折而导致残疾，既影响患者的生活质量又降低其预期寿命，给社会带来沉重的经济负担，已经成为危害公共健康的全球性问题。因此，OP的预防与治疗亟待解决。目前，OP的病因及发病机制尚未清楚，有待深入研究。最近的研究发现，在OP的发生及发展过程中，骨形成与骨吸收之间的平衡受到一些重要分子的调控，比如：Dickkopf-1(DDK1)、酪蛋白激酶2相互作用蛋白1(casein kinase 2 interacting protein 1,CKIP-1)。DKK1是DKKs (Dickkopfs) 家族中的一种分泌型糖蛋白，可抑制Wnt信号通路。原理是：其与Kremen2 结合形成二聚体，所形成的二聚体再与LRP5/6结合形成三聚体，使吸附在细胞膜上的LRP6 内陷而脱离Wnt 复合物，阻断Wnt信号通路，从而抑制骨的形成。DDK1与骨代谢疾病[26]及肿瘤[27]发生密切相关，在OP患者呈现出高表达状态。刘媛等人[28]针对 DKK1 基因构建两段小干扰 RNA(siRNA) 真核表达载体来观察其对OP大鼠的治疗作用，并应用RT-PCR和免疫组化的方法分别检测股骨DKK1 mRNA及其蛋白的表达，结果发现，与对照组相比，治疗组大鼠 DKK1-mRNA 及其蛋白的表达明显下降。此外，该实验还通过测定股骨骨密度及病理结构变化发现，治疗组大鼠股骨有新生骨小梁形成，骨小梁破坏减轻，从而初步阐明DKK1-siRNA 促进骨形成， 抑制骨吸收， 减轻骨结构的破坏。CKIP-1作为一种新的骨形成负调控因子，在骨细胞形态、生长、分化和凋亡中起关键作用。有研究报道，CKIP-1与OP有密切关系[29]。Guo等[30]发现，不论在体外实验还是体内实验，将CKIP-1 siRNA转入成骨细胞或老鼠体内之后，CKIP-1 mRNA及其蛋白的表达明显下降。另外，该研究的体内实验还发现，与非处理组相比，处理组的骨量及骨形成标记物显著增高，从而初步表明CKIP-1 siRNA可促进成骨分化，刺激骨形成，减少骨量丢失。OP发生是一个非常复杂的变化过程，从以上研究提示CKIP-1和DDK1只是OP骨代谢过程中2个重要的调控因子，其他关键因子是否也参与了调控过程仍需研究探讨。因此，siRNA特异性诱导目的基因沉默有望成为治疗OP的新思路。

4siRNA技术在股骨头缺血性坏死中的应用

临床上，股骨头缺血性坏死(Osteonecrosis of the femoral head，ONFH)可导致患者髋关节疼痛、活动受限、跛行等，严重影响患者的生活质量。近年来，随着股骨头缺血性坏死发病率的增加，研究者们越来越关注该疾病。由于ONFH的病因和发病机制尚不完全明确，这给骨科医生对该疾病的预防和治疗带来了极大的困难。最近的研究[31，32]表明，过氧化物酶体增殖子活化受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor-γ,PPARγ)与ONFH密切相关，而关于PPARγsiRNA在ONFH的研究中鲜见。PPARγ是一种能够调节细胞分化的成脂转录因子，可促进干细胞向脂肪细胞发展的同时抑制骨的形成。2015年李劲峰等[33]构建能够沉默 PPARγ的PPARγsiRNA和表达 CGRP 的双基因重组载体，将载体转染的骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)植入兔酒精性ONFH模型的股骨头内，观察其对酒精性股骨头坏死的预防效果，发现实验组股骨头组织内PPARγmRNA及其蛋白的表达比对照组低，CGRPmRNA及其蛋白的表达高于对照组。初步表明了沉默 PPARγ的PPARγsiRNA和表达 CGRP 的双基因重组载体能有效阻断酒精诱导的BMSCs 内 PPARγ mRNA 和蛋白的表达，抑制细胞的成脂分化，同时增加了BMSCs 的成骨相关基因及蛋白的表达，增强了其成骨分化的能力，从发病机制的初始关键环节上更高效地预防酒精性 ONFH 发生。ONFH的病因较多，环节复杂，酒精可能只是其中一种病因而已。从上述研究结果显示PPARγ沉默后能阻断ONFH的进程，是一个比较理想的基因治疗靶点。至于其他原因导致的ONFH是否存在同样的结果需进一步探讨。因此，siRNA诱导股骨头缺血性坏死发生发展相关基因的沉默，对预防和治疗股骨头缺血性坏死有重要的应用前景。

综上所述，siRNA诱导目的基因沉默可应用于骨关节炎、骨质疏松症、股骨头缺血性坏死、骨肉瘤等多种骨科疾病，并取得了一定的成就，具有良好的应用价值。这只是siRNA对几种相关骨科疾病的初步认识。然而，RNAi技术尚未完全成熟，并且仅局限应用于活体动物及细胞等基础研究，其相关药物还处于临床验证阶段。虽然siRNA药物真正应用于临床尚需时日，但随着RNAi技术的深入研究，其必将成为治疗更多骨科疾病或其他系统疾病的新工具。

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(编辑：梁明佩)

(收稿日期：2016-03-08修回日期：2016-04-22)

中图分类号：R738.1

文献标识码：A

DOI:10.3969/j.issn.1003-1383.2016.02.023

作者简介：农峰，男，在读硕士研究生。E-mail:nfeng123456@sina.cn▲通信作者：蓝常贡。E-mail:landlong120@sina.com

基金项目：广西医疗卫生重点科研课题(重2012083)；2011年广西教育厅科研项目(201106LX431)；2010年广西卫生厅

重点科研课题(桂卫科教〔2010〕22 号)