基于随机采样的快速超分辨荧光成像技术研究及其样机实现

宓现强 中国科学院上海高等研究院

基于随机采样的快速超分辨荧光成像技术研究及其样机实现

宓现强 中国科学院上海高等研究院

光学显微成像技术具有无损、非接触、高特异性、高灵敏、高活体友好以及能够提供功能信息等突出优点，在生物医学和材料科学领域有广泛的应用。并且由于其具有三维层析成像能力，可借助荧光标记等其他技术手段对于样品内部的结构和生化反应进行针对性的观察，是获知生物体结构、形貌以及临床医学诊断等领域非常重要的工具。近年来随着生命科学和临床医学的发展，迫切需要一种既具有纳米尺度的光学分辨本领，还可以连续监测生物大分子和细胞器微小结构、功能的演化，同时不影响生物体系生物活性的光学成像显微技术。然而传统光学显微成像技术的空间分辨率受衍射极限的限制，无法做到小于200nm分辨率，只能观测到微米至亚微米级的结构形貌。

为了突破光学显微成像技术的衍射极限，科学家不断地寻找新的方法来提高显微成像技术的分辨率。1957年，Marvin Minsky在哈佛大学最早提出了共聚焦（Confocal）的概念，并对载物台扫描共聚焦显微镜申报了美国国家专利（US Pat. 3013467）。1987年出现了第一台激光扫描共聚焦显微镜商业产品。至此，共聚焦显微技术已基本发展到比较成熟的阶段。然而，共焦显微镜的分辨率只是在宽场显微镜上提升约1.4倍，仍然不能突破光学衍射极限。近年来，Stefan W. Hell等人[1,2]提出的STED和基态倒空（Ground state depletion，GSD）荧光成像技术，庄小威等人[3]提出的STORM技术，Eric Betzig等人[4]和Samuel T. Hess等人[5]提出的光激活定位超分辨成像方法（Photo-activated localization microscopy，PALM），突破了光学衍射极限的限制，使光学显微镜的成像分辨能力提高到几十纳米。为此，2014年诺贝尔化学奖颁给了在光学超分辨分子成像技术中做出突出贡献的有关科学家。

STORM技术是利用了荧光探针具有光开关的特性，用特定波长的激光来激活探针，然后用另一个波长激光来观察、精确定位以及漂白荧光分子，将此过程循环足够多次后重构得到高分辨率图像的方法。由于具有激发强度小、宽场分辨能力高、荧光染料适用性强等特点，STORM技术被广泛应用于生物医学领域的研究。在细胞生物研究中，STORM技术实现了对亚细胞组织结构（例如微管、肌动蛋白和线粒体等）的高精度观察。如Bates等人[6]利用STORM 观察了BS-C-1细胞的线粒体网络结构，分辨出重叠或者之前的显微技术不能分解的细丝。在神经生物学研究中，STORM技术提供了研究只有几十纳米的神经突触的构型以及信息相互传递的新方法。例如，Dani等人[7]利用STORM技术研究了神经递质在神经轴突传递的方式以及神经突触在神经细胞上的分布。Xu等人[8]利用STORM 技术对神经元中发挥重要作用的肌动蛋白和血影蛋白在轴突和树突的组织结构进行了高分辨成像。在微生物研究领域中，STORM技术提供了对极小尺寸的细菌、病毒等的结构、功能及机制研究的高分辨成像方法。Wang等人[9]用STORM技术发现了细菌中H-NS蛋白与DNA结合并在染色体中形成紧凑的聚集体。

相比于国外，国内高端光学显微镜的研究起步较晚。直到90年代初，我国才引进第一台激光扫描共聚焦显微镜（laser scanning confocal microscope，LSCM）。2011年中科院生物物理研究所引进了国内第一台基于结构光学显微技术（Structured Illumination Microscopy，SIM）的超分辨显微镜（美国API公司OMX）。目前，国内对高端显微镜（如共聚焦显微镜）的需求每年以20%的量增加，全部依靠进口。最近十年来，一些重点院校研究所，如浙江大学，中国科技大学，北京大学、华中科技大学、深圳大学、上海理工大学、中国科学院上海光学精密机械研究所、中国科学院上海应用物理研究所等逐渐开展了在超分辨显微技术领域的研究。

鉴于STORM技术的巨大价值和应用前景，围绕着STORM技术的生物医学应用和技术不断完善，国内许多机构也纷纷开展了相关研究。深圳大学光电工程学院的牛憨笨院士研究团队[10]采用了双物镜聚焦设计了STORM结构，抑制了焦平面外的荧光干扰，提高了单分子的定位精度，加大了系统的景深。上海交通大学生命科学技术学院的孙洁林课题组[11]采用汞灯代替激光光源，设计了STORM，实现了30nm的横向分辨率。中国科学院苏州生物医学工程技术研究所熊大曦课题组[12,13]通过分析柱透镜参数选择上的优劣，优化并提高了STORM轴向定位的精度和深度。

STORM技术超高空间分辨率的能力主要依赖于极高的单分子定位精度，即在采集图像时，对应每一帧图像只能激活少量荧光分子。但其缺点是为了收集足够多的光子数来重构一幅完整的图像，通常需要几千帧的采样数，导致采样效率被约束。同时，当获得数据后进行单分子拟合等数据处理时，通常也需要几分钟至几十分钟（针对不同的样品甚至需要几小时）来得到一幅高分辨图像。这对生物体内的生理病理发生发展过程，如病毒入侵、细胞的胞饮胞吞及物质进入细胞后的途径等进行实时动态观察来说是远远不够的。而这些过程恰恰对人们更加直观的理解生命现象，揭示各种疾病的发病机理具有重要的意义。

提高STORM技术成像速度的解决途径主要有两种：一是在同等采样帧数下，加快采样速率，从而提高成像速度。这就需要增大激发光的强度、缩短荧光染料的光开关时间、使用更加快速的探测器。这类方法是传统STORM系统的进一步优化，然而较高的激发光强度会引起样品的损害，不利于对生物样品活性功能的观察，而且由于采样帧数没有减少，并不能提高基于传统单分子拟合的图像重构速度。二是减少图像重构所需的采样帧数。这就需要增大荧光分子的激发密度，使得每帧可以累积更多的单分子事件来减少采样帧数。在较高的激发密度下，传统单分子拟合定位算法便不再适用，以此而发展起来的多分子拟合算法虽然可以提高荧光分子的定位精度，但是在图像重构速度方面还是较慢。

为解决这一关键前沿技术问题，中科院上海高等研究院宓现强研究团队、王中阳研究团队及中科院光机所韩申生研究团队联合上海市公共卫生临床中心申请的“基于随机采样的快速超分辨荧光成像技术研究及其样机实现研究”项目获得2016年国家重点研发计划“数字诊疗装备研发”专项支持（项目编号2016YFC0100600），拟在上述领域获得突破。具体内容包括发展基于荧光共振能量转移（Fluorescence resonance energy transfer，FRET）的高效率荧光探针，从物理采样模式上进行革新，将压缩感知的随机采样（Random Sampling，RS）模式运用于STORM成像技术中，大幅度减少原有的采样帧率，使得成像效率可以得到数量级的提升；搭建与集成具有自主知识产权的RSSTORM样机，并且将此样机用于乙肝病毒（Hepatitis B virus，HBV）入侵肝细胞的实验观察和验证。

[1] S. W. Hell and J. Wichmann, Opt. Lett. 19,780(1994).

[2] S. W. Hell and M. Kroug, Appl. Phys. B 60,495(1995).

[3] M. J. Rust, et al., Nat. Meth. 3,793(2006).

[4] E. Betzig, et al., Science 313,1462(2006).

[5] S. T. Hess, et al., Biophys. J. 91,4258(2006).

[6] Bates, M. ; Huang, B. ; Dempsey, G. T., Science. 317,1749-53(2007).

[7] Dani, A. ; Huang, B. ; Bergan, J. ; Dulac, C., Neuron. 68,843-56(2010).

[8] Xu, K. ; Zhong, G. ; Zhuang, X., Actin, Science. 339,452-6(2013).

[9] Wang, W. ; Li, G. W. ; Chen, C. ; Xie, X. S. ; Zhuang, X., Science. 333,1445-9(2011).

[10] Chen D, Yu B, Qu J, Niu H Opt. Lett. 35 886(2010).

[11] Zhai Ren-kuan, et al., J. Chin. Electr. Microsc. Soc. 30,527-532(2011).

[12] Zhang Shi-chao, et al., Acta Photonica Sinica. 44,1017003(2015).

[13] Yang Guang, et al., Acta Biophysica sinica. 30,380-390(2014).