几种胶原样凝集素的生物学特性及其抗病原微生物的作用

李 兰 ， 郑其升 ， 付言峰 ， 肖希龙 ， 侯继波

(1.江苏省农业科学院畜牧研究所 ， 江苏南京210014 ； 2.国家兽用生物制品工程技术研究中心 ，江苏南京210014 ； 3.中国农业大学动物医学院 ， 北京海淀100193)

几种胶原样凝集素的生物学特性及其抗病原微生物的作用

李 兰1，2， 郑其升1，2， 付言峰1， 肖希龙3， 侯继波1，2

(1.江苏省农业科学院畜牧研究所 ， 江苏南京210014 ； 2.国家兽用生物制品工程技术研究中心 ，江苏南京210014 ； 3.中国农业大学动物医学院 ， 北京海淀100193)

1 胶原样凝集素概况

胶原样凝集素属于脊椎动物C-型凝集素超家族，具有相似的分子结构，每个单体由N末端区域、胶原样区域(CollagenLikeRegion，CLR)、起连接作用的茎区和碳水化合物识别区域(Carbo.hydrateRecognitionDomain，CRD)等4个结构域组成[1]，单体之间形成同源三聚体，三聚体单元会进一步组合成为多聚体形式，不同的胶原样凝集素其三聚体单元数目是不同的。凝集素自发现至今逐渐引起各国科学家的关注，其CRD结构域已成为一个研究热点，化学家着眼于其糖识别的分子机制，免疫学家则集中于CRD的天然免疫功能，如调理吞噬、补体激活及炎症反应等[2]，近几年越来越多的研究证明，凝集素还具有中和病原微生物包括病毒、细菌和真菌的生物学功能[3-6]。

关于凝集素抗微生物的研究，在人医领域研究较多，而在兽医领域研究相对较少。大量的临床和动物模型试验表明甘露聚糖结合凝集素(MBL)、肺表面活性蛋白A、D(SP-A、D)或纤维胶凝蛋白(Ficolin)缺乏会增加机体对病原微生物的感染，利用基因敲除的方法构建缺失上述胶原凝集素的小鼠模型是研究凝集素在体内发挥作用的有效方法，如缺失1种或2种MBL的小鼠感染金黄色葡萄球菌，以野生型小鼠作为对照，结果显示，感染48h，缺失MBL的小鼠全部死亡，而野生型小鼠有60%的存活率[7]，另外基因敲除鼠给予重组表达的人MBL，其存活率与野生型小鼠持平；缺失Ficolin A、Ficolin B和同时缺失两种Ficolin的小鼠感染肺炎链球菌，结果显示，其存活率显著降低[8]，以上充分证明了MBL等凝集素在机体抵御病原微生物的重要作用。

本文将介绍甘露聚糖结合凝集素、肺表面活性蛋白A、D(SP-A、D)和纤维胶凝蛋白等脊椎动物胶原样凝集素的中和微生物作用及其可能的作用机制，为抗微生物药物的研发提供一种新的思路及方向。

2 中和微生物作用

2.1 MBL 有关人MBL的研究比较深入，MBL能够中和流感病毒、胸膜肺炎放线杆菌、埃博拉病毒、HIV、立百病毒等。Kase等[9]于1999年报道了人MBL能够直接抑制流感病毒的感染，研究采用蚀斑减少试验评价了用两种不同方法制备的人MBL中和流感病毒的能力，结果显示，从血清中提取的MBL和CHO细胞表达的MBL均能够显著降低流感病毒在MDCK细胞上的感染，0.125 μg/mLMBL抑制率达到50%，0.25 μg/mLMBL抑制率达到90%，1.0 μg/mL MBL抑制率甚至达到100%。

哈佛大学医学院一研究团队[7]对MBL抗微生物作用进行了大量的研究，并且重组MBL已经被开发出来且于2006年已经通过Ⅰ期临床试验，但后来的研究发现，额外补充的MBL能够在体内引起一种副反应，即干扰体内血凝系统，临床试验被迫停止。近几年，该研究团队通过结构改造获得了一些MBL的衍生物，具有MBL的活性同时不会干扰血凝系统。嵌合重组凝集素4(RCL4)用L-Ficolin的胶原样区域代替MBL的胶原样区域，而获得，在抗感染方面(流感病毒、埃博拉病毒和立百病毒)有更优越的表现，在体内激活凝集素的作用是MBL的10倍以上，同时激活类凝血酶活性的副作用大大减小。

2.2 SP-A、D 现有研究显示SP-A、D能够中和流感病毒，能够与不同亚型的流感病毒结合，且SP-D抗流感病毒作用表现的更优越[5，10-11]。Marine等[5]研究了猪SP-D作为一种抗流感病毒药物的潜在应用价值，血凝抑制试验评价了包括H1N1、H3N2、H5N1等在内的30株流感病毒与猪SP-D的作用，结果显示，SP-D以不同的亲和力与不同亚型的流感病毒结合，进一步研究显示，猪SP-D能够抑制流感A病毒(IAV)感染MDCK细胞，具有中和IAV的作用；Benne等[12]发现，人SP-A能够直接作用于H1N1和H3N2亚型流感病毒；张峰等[4]研究发现，HEK 293T细胞表达的重组猪SP-A蛋白能够与PRRSV进行结合，且能够降低在Marc-145细胞和猪肺泡巨噬细胞的感染，表明猪SP-A具有抗PRRSV的活性；另有研究显示，SP-A能够抵抗1型单纯疱疹病毒、肺炎肺囊虫、真菌烟曲霉分生孢子、呼吸道合胞体病毒、金黄色葡萄球菌、假单胞杆菌、大肠杆菌J5、结核分枝杆菌、肺炎链球菌、A族和B族链球菌等的感染；SP-D也有相似的抗微生物谱。

2.3 Ficolin Ficolin对病原微生物的直接作用也有报道，Keirstead等[3]研究发现，Ficolin及重组Ficolin能够与PRRSV结合，并且采用蚀斑减少试验比较了从猪血清中提取的Ficolin及在细胞中表达的Ficolin中和PRRSV的作用，结果显示，两者都能够中和PRRSV，不过前者作用更强，还进一步发现，Ficolin能够与沙门菌和胸膜肺炎放线杆菌结合；Michalski等于2015年首次证实，人H-Ficolin能够抵抗蜂房哈夫尼菌的感染；还有研究显示，人L-Ficolin能够与A型流感病毒结合，进而抑制其进入MDCK细胞，发挥直接抗病毒作用，另外Ficolin还能够与大肠杆菌、沙门菌、福氏志贺菌、粘质沙雷菌和铜绿假单胞菌等等革兰阴性菌结合，且能够与金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、链球菌革兰阳性菌结合。

3 抗微生物作用机制

多个研究结果表明，凝集素是通过阻断病毒的吸附或细菌等粘附而发挥作用的，尤其关于抗病毒的作用机制研究较多。Keyaerts等[6]发现HHA，一种来源于植物的甘露糖凝集素，主要作用于病毒的吸附阶段，当病毒与细胞在4 ℃孵育时，病毒仅发生吸附作用而不能内化进细胞，HHA的EC50为 2.5 μg/mL，但当病毒与细胞在37 ℃孵育时，病毒即发生吸附作用又能内化进入细胞，此时HHA的EC50为5.2 μg/mL；另有Marine等[5]人的研究成果显示，重组表达的SP-D能够100%阻断H1N1和H3N2的吸附，但该研究并没有进一步研究SP-D对病毒内化的影响，也许认为SP-D能够完全阻断病毒的吸附，再进行病毒内化试验已经没有意义；还有很多文献报道了通过阻断HIV和HCV进入靶细胞而发生抗病毒作用的多种凝集素，如来源于哺乳动物的MBL、DC-SIGN、SP-D等、来源于原核生物的Scytovirin、来源于海洋珊瑚的Gerardia savaglia、种类丰富的植物凝集素HHA和GNA、来源于无脊椎动物的Chaetopterus variopedatus[13]。

大量研究资料显示，微生物表面糖基在病毒吸附的过程中发挥重要作用。如HIV的gp120和gp40糖蛋白[14]、HCV的E1和E2糖蛋白[15]、IAV的HA和NA糖蛋白[14]、SARS-CoV的S和ACE2糖蛋白等[14，16]。SP-A可与呼吸道合胞病毒表面的F(融合)糖蛋白结合，从而抑制F蛋白的融合功能，进而抑制病毒入侵[17]其次：Marine研究结果证明，SP-D能够和流感病，毒表面的HA相互作用，阻止病毒附着到靶细胞而发挥病毒中和的作用[5]；此外，一些来源不同的凝集素如SP-D、植物凝集素已被证实可以与HIV表面的糖蛋白gp120和gp40结合，与凝集素结合后的HIV可能由于空间位阻的原因不能与受体蛋白CD4CXCR4或CCR5结合，从而阻断HIV进入靶细胞而降低感染率[1，18]，综上所述，凝集素很可能通过与病原微生物表面的糖蛋白中的一种或几种结合，抑制了病毒靶细胞上的受体的识别及结合，从而阻断了病毒的吸附过程。

4 结语

以微生物入侵作为作用靶点的抗微生物药物有其独特的优势，不仅可以阻断健康细胞的感染，还能阻断感染细胞向健康细胞传播病毒的途径[13]，所以凝集素在人医领域已被列为抗HIV的潜在药物。同时与普通病毒入侵抑制剂相比，凝集素还能够通过自身受体阻止HIV病毒向树突状细胞及巨噬细胞的传播[19-20]，进一步降低HIV在机体内的传播机会，因此凝集素作为一类新型抗微生物药物越来越受到药物开发者的青睐。

[1] Pandit H，Gopal S，Sonawani A，etal.Surfactant protein D inhibits HIV-1 infection of target cells via interference with gp120-CD4 interaction and modulates pro-inflammatory cytokine production[J].PloS one，2014，9(7)：e102395.

[2] Takahashi Kazue.Mannose-binding lectin and the balance between immune protection and complication[J].Expert review of anti-infective therapy，2011，9(12)：1179-90.

[3] Keirstead N D，Lee C，Yoo D，etal.Porcine plasma ficolin binds and reduces infectivity of porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV)in vitro[J].Antiviral Res，2008，77(1)：28-38.

[4] 张峰.重组猪肺表面活性蛋白A 在体外抑制PRRSV 感染宿主细胞的研究[D].保定：河北农业大学，2012.

[5] Martin van Eijk Marine L B.Hillaire，Stella E.van Trierum，Debby van Riel，etal.Rimmelzwaan Henk P.Haagsman.Assessment of the Antiviral Properties of Recombinant Porcine SP-D against Various Influenza A Viruses In Vitro[J].PloS one，2011，6(9).

[6] Keyaerts E，Vijgen L，Pannecouque C，etal.Plant lectins are potent inhibitors of coronaviruses by interfering with two targets in the viral replication cycle[J].Antiviral Res，2007，75(3)：179-187.

[7] Chang W C，Takahashi K，Takahashi M.Mannose-binding lectin and its associated proteases(MASPs)mediate coagulation and its deficiency is a risk factor in developing complications from infection，including disseminated intravascular coagulation[J].Immunobiology，2011，216(1-2).

[8] Endo Yuichi，Takahashi Minoru，Iwaki Daisuke，etal.Mice deficient in ficolin，a lectin complement pathway recognition molecule，are susceptible to Streptococcus pneumoniae infection[J].Journal of Immunology，2012，189(12)：5860-5866.

[9] Kase T，Suzuki Y，Kawai T，etal.Human mannan-binding lectin inhibits the infection of influenza A virus without complement[J].Immunology，1999，97(3)：385-392.

[10] Kishore U，Greenhough T J，Waters P，etal.Surfactant proteins SP-A and SP-D：structure，function and receptors[J].Mol Immunol，2006，43(9)：1293-1315.

[11] Benne C A，Kraaijeveld C A，van Strijp J A，etal.Interactions of surfactant protein A with influenza A viruses：binding and neutralization[J].J Infect Dis，1995，171(2)：335-341.

[12] Benne C A，Benaissa-Trouw B，van Strijp J A，etal.Surfactant protein A，but not surfactant protein D，is an opsonin for influenza A virus phagocytosis by rat alveolar macrophages[J].Eur J Immunol，1997，27(4)：886-890.

[13] Balzarini J.Inhibition of HIV entry by carbohydrate-binding proteins[J].Antiviral Res，2006，71(2-3)：237-247.

[14] Balzarini J.Carbohydrate-binding agents：a potential future cornerstone for the chemotherapy of enveloped viruses[J].Antiviral Chemistry & Chemotherapy，2007，18(1)：1-11.

[15] Deleersnyder V，Pillez A，Wychowski C，etal.Formation of native hepatitis C virus glycoprotein complexes[J].Journal of virology，1997，71(1)：697-704.

[16] Kuhn J H，W Li，Choe H，etal.Angiotensin-converting enzyme 2：a functional receptor for SARS coronavirus[J].Cellular & Molecular Life Sciences Cmls，2004，61(21)：2738-2743.

[17] Ghildyal R，Hartley C，Varrasso A，etal.Surfactant protein A binds to the fusion glycoprotein of respiratory syncytial virus and neutralizes virion infectivity[J].J Infect Dis，1999，180(6)：2009-2013.

[18] Meschi J，Crouch E C，Skolnik P，etal.Surfactant protein D binds to human immunodeficiency virus(HIV)envelope protein gp120 and inhibits HIV replication[J].J Gen Virol，2005，86(Pt 11)：3097-3107.

[19] Teunis B.H Geijtenbeek，Douglas S Kwon，Ruurd Torensma，etal.DC-SIGN，a dendritic cell-specific HIV-1-binding protein that enhances trans-infection of T cells.Cell[J].Cell，2000，100(5)：587-597.

[20] Deborah，Greene Nguyen.Involvement of macrophage mannose receptor in the binding and transmission of HIV by macrophages[J].European Journal of Immunology，2003，33(2)：483-493.

2016-4-19

农业部公益性行业(农业)科研专项经费项目(2013-03046)

李兰(1983-)，女，博士生，主要从事新兽药研究工作，E-mail：lanli99@foxmail.com

肖希龙，E-mail：xiaoxl@cau.edu.cn；侯继波，E-mail：houjibo@jaas.ac.cn

S852.65

A

0529-6005(2016)11-0076-03