龙胆苦苷对人肝癌HepG2细胞的抑制作用

赵忠伟 韩 鹏

(长春大学，吉林 长春 130022)

龙胆苦苷对人肝癌HepG2细胞的抑制作用

赵忠伟 韩 鹏1

(长春大学，吉林 长春 130022)

目的 观察龙胆苦苷对体外培养的人肝癌HepG2细胞的抑制作用。方法 采用噻唑蓝法(MTT)和流式细胞术(FCM)研究龙胆苦苷对HepG2细胞的增殖抑制作用和对细胞周期的影响。 结果 龙胆苦苷能够抑制肝癌细胞的增殖，且呈剂量依赖性，半抑制常数IC50为107.93 μg/ml；随着其作用浓度的增大，肝癌细胞期S和G2/M期细胞减少，G0/G1期细胞增多；Sub-G1期细胞变化明显，出现明显的凋亡峰。 结论 龙胆苦苷具有抑制肝癌细胞增殖和改变细胞周期分布的作用，对肝癌的中药治疗具有重要的指导意义。

龙胆苦苷；肝癌细胞；增殖抑制

肝癌恶性程度高、治疗难度大、死亡率高。积极开展肝癌的中医药防治研究具有特别重要的意义。龙胆在我国资源丰富，属大宗常用中药材。临床上龙胆具有泻肝胆实火、清下焦湿热的功效，用于护肝、利胆、健胃、抗炎等〔1〕。最近有研究报道显示龙胆还有抗肿瘤、抑制癌细胞生长的作用〔2,3〕。龙胆苦苷是龙胆植物中的主要药理活性成分〔4〕，因此龙胆苦苷极可能是龙胆发挥抗肝癌作用的主要活性成分。本文初步研究龙胆苦苷对人肝癌HepG2细胞增殖和细胞周期的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 龙胆苦苷购于柳河县恒信北药种植有限公司。人肝癌HepG2细胞株购于上海细胞所，由本实验室传代培养。DMEM培养液为Invitrogen公司产品，胎牛血清为四季青公司产品。四甲基偶氮唑蓝(MTT)为Sigma公司产品。

1.2 细胞培养 人肝癌HepG2细胞的培养基为DMEM培养液加10 %胎牛血清，在37℃、5 % CO2细胞培养箱中培养，胰蛋白酶消化传代，以备实验使用。

1.3 体外细胞增殖抑制实验(MTT法) 将对数生长期的细胞，以1×104个/ml的浓度接种于96孔细胞培养板内，放入二氧化碳培养箱中，37℃培养24 h后去旧培养液，每个孔分别加入200 μl含有不同浓度(25、50、100、200 μg/ml)的龙胆苦苷培养液，每组4个复孔；阴性对照组中加入与加药组等量溶剂的基础培养液。经过72 h的培养后吸弃上清，每孔加入150 μl MTT(5 mg/ml)的培养液，37℃继续孵育；4 h后吸弃上清液，每孔中加入150 μl DMSO溶液振荡，在37℃完全溶解后，用酶联免疫检测仪在490 nm波长测定吸收值(A)，参考波长为630 nm。细胞生长抑制率=(1-实验组A值/对照组A值)×100%。

1.4 流式细胞术(FCM)测定细胞周期 分别收集龙胆苦苷加药组(龙胆苦苷浓度为100 μg/ml)和未加药干预对照组的细胞，PBS清洗2次，经80%预冷乙醇固定，在4℃冰箱中放置过夜；离心，弃除上清，将细胞沉淀经PBS洗涤2次，加入不含DNA酶的100 g/ml 的RNase A重悬细胞，37℃培育30 min；再加入100 g/ml的PI染液在4℃避光孵育30 min，将样品经350目绢筛过滤，除去成团细胞，放入Coulter EPICS XL流式细胞仪检测，对群体细胞中G0/G1、S和G2/M期细胞百分率及凋亡率进行分析。

2 结 果

2.1 龙胆苦苷对人肝癌HepG2细胞增殖的影响 MTT法检测结果表明，龙胆苦苷能够抑制HepG2细胞的增殖，25、50、100、200 μg/ml龙胆苦苷组HepG2细胞抑制率分别为(10.7±6.3)%、(29.3±5.3)%、(48.4±3.8)%、(89.4±5.1)%。随着浓度的增加，抑制程度逐渐加强，IC50值为107.93 μg/ml。

2.2 龙胆苦苷对人肝癌HepG2细胞周期的影响 FCM检测发现：龙胆苦苷作用HepG2细胞72 h后，细胞的S期和G2/M期细胞均减少，S期从34.4%降低到16.8%，G2/M期细胞从21.3%降低到12.5%，而G0/G1期细胞比例增加，从39.2%增加到50.4%。表明龙胆苦苷改变了肝癌细胞的周期分布，使HepG2细胞阻滞在了G0/G1期。

2.3 龙胆苦苷诱导人肝癌HepG2细胞凋亡 龙胆苦苷作用后，在G0/G1期前出现二倍体亚峰(Sub-G1)即凋亡峰，凋亡率由5.1 %增加到20.3%。

3 讨 论

肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，其恶性程度高、治疗困难。中草药来源广泛，在肝癌的防治方面有一定优势，因此国内外对于肝癌的中医药防治都有着迫切需求〔5〕。

中药龙胆具有健胃、利胆、护肝、抗炎、抗菌、升血糖、降压及抗肿瘤等作用〔4〕。龙胆资源丰富，虽然作为健胃剂已经在国际天然药物界内被广泛认可和接受，但其抗癌作用尚未引起足够重视。有研究发现从龙胆中分离获得的乙醇提取物具有抑制小鼠肉瘤、早幼粒细胞性白血病、卵巢癌、肺癌和肝癌等肿瘤细胞增殖的作用〔2,6,7〕；龙胆的热水提取物也具有抑制肿瘤细胞增殖的作用〔8〕。龙胆苦苷是龙胆根及根茎中含有的主要化学成分，龙胆苦苷具有强烈的苦味活性，是龙胆药苦寒的物质基础，是评价龙胆质量的首要指标。龙胆苦苷属裂环环烯醚萜类化合物。有研究显示，含有龙胆苦苷的中草药提取物能够抑制肝癌SMMC-7721细胞的增殖〔9〕。因此，笔者推测龙胆苦苷在龙胆发挥抗肝癌作用过程中起着很重要的作用。

肿瘤的发生是由于细胞生长和凋亡失调、细胞周期发生紊乱。所以现在通常认为肝癌细胞增殖的抑制和癌细胞周期的改变以及诱导癌细胞发生凋亡是目前抗肝癌的一种治疗手段。本研究结果表明：龙胆苦苷能够剂量依赖性抑制HepG2细胞的增殖；使HepG2细胞的G0/G1细胞增多，改变了肝癌细胞的周期；在此基础上，还发现龙胆苦苷可以诱导肝癌细胞发生凋亡。可见，龙胆苦苷对于肝癌的治疗效果与龙胆苦苷对肝癌细胞增殖的抑制作用，和改变细胞周期分布及促进细胞凋亡的作用关系密切。

1 唐庆栓.龙胆的临床研究进展〔J〕.齐齐哈尔医学院学报,2011;32(13):2156-7.

2 郭海凤,朴惠顺.关龙胆抗肿瘤活性实验研究〔J〕.中药材,2010;33(6):131-4.

3 蒋素强,任中海,李新民.龙胆胶囊体内外抗肿瘤作用的实验研究〔J〕.中国实验方剂学杂志,1998;4(6):43-4.

4 曹斐华,李冲龙.龙胆属植物化学成分及药理作用的研究进展〔J〕.中国新药杂志,2008;17(1):27-9.

5 陈 坚.中药治疗肝癌的实验研究进展〔J〕.中西医结合肝病杂志,2000;10(3):55-7.

6 郭海凤,张善玉,朴惠顺.关龙胆乙醇提取物对小鼠S180肉瘤的抑制增殖作用〔J〕.延边大学医学学报,2009;32(4):256-7.

7 Wu QX,Liu X,Shi YP.Chemical components from Gentiana aristata〔J〕.Chem Biodivers,2007;4(2):175-82.

8 Ozturk N,Korkmaz S,Ozturk Y,etal.Antiproliferative activity of root extract from Gentian plant (Gentiana triflora) on cultured and implanted tumor cells〔J〕.Biosci Biotechnol Biochem,2006;70(4):1046-8.

9 黄馨慧,罗明志,齐 浩,等.龙胆苦苷等6种中草药提取物对SMMC-7721人肝癌细胞增殖的影响〔J〕.西北药学杂志,2001;19(4):166-8.

〔2016-10-25修回〕

(编辑 曲 莉)

国家科技部科技型中小企业技术创新基金项目(11C26212200647)；吉林省道地药材龙胆草基地建设

韩 鹏(1979-)，女，博士后，主要从事生物化学与分子生物学研究。

赵忠伟(1977-)，男，讲师，主要从事中医药学研究。

R735.7

A

1005-9202(2016)24-6082-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.24.016

1 吉林农业大学生命科学学院