益生菌对环境的适应性研究进展

潘　娜，王　开，胡桂学

（吉林农业大学动物科学技术学院，吉林 长春 130118）

益生菌对环境的适应性研究进展

潘娜，王开，胡桂学

（吉林农业大学动物科学技术学院，吉林 长春 130118）

益生菌被定义为有益于消费者健康的活的微生物，分为乳杆菌类、双歧杆菌类、革兰阳性球菌3类。益生菌能够调节缓解乳糖不耐受、肠道菌群平衡、改善肠道功能、促进机体对营养物质的吸收、降低血清胆固醇[1]及血压、调节机体的免疫机能[2]、减少氧化应激等发挥益生作用[3-4]，与人类健康息息相关。被广泛应用于发酵乳制品、肉制品、泡菜、饲料、护肤品等，其代谢产物细菌素也被用于食物的储藏[5]。益生菌在食品发酵和消化道消化过程中，能在不理想的情况下生长和存活，引起了很多研究者对其应激反应机制的兴趣。研究发现，益生菌为了适应环境的胁迫会进行应激改变，也有些研究者发现改变益生菌某些基因后，会对环境的适应性发生改变，而益生特性也会随之发生改变。因此，本文就环境威胁时益生菌出现的改变及与环境适应性相关的基因做一综述。

1　环境胁迫

1.1盐胁迫细胞膜具有可渗透性，环境渗透压的改变会影响细胞的生理功能，益生菌面临渗透胁迫时膜蛋白可直接或间接调节细胞膜对盐离子的渗透性，Na+/H+逆向转运蛋白会外排Na+，阻止Na+的积累，减轻Na+对菌体细胞的毒害作用，同时通过增加对K+的吸收，恢复Na+/K+比，恢复细胞内离子和水浓度，以及吸收和合成相容性物质[6]。杨振泉研究发现，高浓度盐（8%）能抑制益生菌的生长代谢，产酸减少，而高浓度盐对盐敏感性乳酸菌的抑制是发酵周期延长的主要原因，因此提高起始耐盐性乳酸菌数量，可以加快高盐泡菜成熟[7]。Fredericf研究发现，清酒乳杆菌CTC494在盐胁迫条件下细菌素产量会下降，适量氯化钠（2.3%～2.5%）能够刺激LPC010产生细菌素[8]。乌日娜研究发现，在分子伴侣蛋白调控系统中，基因groEL、groES、dnaK、dnaJ、hsp1、hsp2、usp随着NaCl浓度升高而上调，呈正相关[9]，其具体机制仍需进一步研究。

1.2胆盐胁迫益生菌对胆盐的耐受性能够反应出其在肠道中的潜在的存活能力。1.0%～3.0%浓度胆盐细菌素浓度较对照组高，抑菌效果最好。0.2%胆盐处理90 min为干酪乳杆菌ATCC393胆盐胁迫的亚适应条件。过高浓度胆盐能使细胞破裂或凋亡，面对胆盐胁迫时，益生菌能通过胆盐水解酶、水解泵，产生应激蛋白抵抗胆盐等多种有毒物质。Ana实验研究发现，罗伊氏乳杆菌CRL1098在胆盐胁迫时，25个蛋白位点发生差异表达，胆水解酶BSH基因明显上调是细胞解毒的重要策略[10]。

1.3酸胁迫益生菌通过肠道时，胃酸是重要的胁迫因素之一。大量研究表明，乳酸菌在pH值5.0～6.5之间细菌素含量最高，pH值过高或过低均会影响益生菌产细菌素的效果[11]。pH值4.0处理90 min时干酪乳杆菌ATCC393处于酸胁迫的亚适应条件。细胞内部的酸化会减弱对酸敏感的酶活性，对蛋白、DNA造成损伤。酸胁迫时，酸应激诱导了许多伴侣蛋白和与脂肪酸合成的相关基因，抑制了关于类异戊二烯合成的甲羟戊酸途径的基因，从而影响了细胞膜的流动性[12]。Renhui Huang等对有酸和无酸处理植物乳杆菌zdy2013也证实了酸处理组显著提高了饱和脂肪酸和环丙烷脂肪酸的比例，不同程度的调控了一些与质子泵、氨基酸代谢、糖代谢、Ⅰ类和Ⅲ类应激反应途径有关的基因。其中脂肪酸合成和碱生产中所涉及的基因表达明显上调[13]。袁峥等也证实了这一点，随着pH值的下降，嗜酸乳杆菌细胞膜质子泵相关酶H+-ATPase活性升高，同时菌体由纤细型变得粗壮，细胞膜单不饱和脂肪酸变多、碳链变长。精氨酸脱亚氨酸酶的酶活性增强，益生菌可能通过这些变化维持细胞正常的生理功能[14]。Wu C研究干酪乳杆菌时发现，天冬氨酸也参与了酸胁迫的耐受性，添加天冬氨酸提高了酸胁迫下干酪乳杆菌的生长性能和存活率[15]。

1.4温度胁迫益生菌在30℃～37℃细菌素产生最高，低温时益生菌生理状态会发生改变，为了适应温度胁迫，益生菌能够诱导冷应激蛋白的合成来维持细胞膜的流动性，维持DNA螺旋及DNA合成效率。同样热胁迫也会对菌体存活造成不利影响，如使非共价键结合不牢，核糖体、RNA的不稳定以及膜流动性的改变。益生菌面对胁迫时，可产生热应激蛋白，大部分热应激蛋白属于分子伴侣蛋白，能够修复蛋白的生物学功能，增强益生菌对热应激的耐受能力[16]。

1.5饥饿胁迫益生菌在营养缺乏的状态下，体内的毒素-抗毒素系统会直接作用于DNA促旋酶和信使RNA，介导一种在不良生长环境下生长的自我调节机制，抑制基因表达，从而降低蛋白的合成速率，有利于自身节省能量和营养，在营养不良的环境中生存。

1.6氧胁迫非自由基类的氧衍生物统称为活性氧族。活性氧族攻击蛋白质、脂类和核酸等细胞物质，是造成细胞衰老和死亡的主要原因之一。在一些乳杆菌发现了催化分子氧形成H2O2和利用脂肪酸的去饱和化反应消耗分子氧清除分子氧[17]。Scott等在Lactococcus lactic氧胁迫中发现FlpA和FlpB蛋白能够调控Zn（II）水平的升高，保护蛋白质己被氧化的自由疏基基团呈还原状态，阻止二硫键的形成，从而避免易受活性氧族的攻击[18]。左芳雷等研究发现，氧胁迫双歧杆菌B.longum BBMN6时，B.longum BBMN6可以通过改变细胞表面结构以适应氧化胁迫，同时产生多磷酸盐作为分子伴侣以保护蛋白质。促进活性氧的降解和维持氧化还原平衡、诱导一般胁迫反应、参与DNA和蛋白质修复、中心代谢途径等生理过程的适应性调整[19]。

1.7乙醇胁迫朱敏研究发现，乙醇胁迫后面包乳杆菌D2-5、植物乳杆菌D5-5、干酪乳杆菌D5-8存活率显著降低，使关键酶丙酮酸激酶、乳酸脱氢酶和ATP酶失活、使细胞膜通透性增加、完整性被破坏[20]。Garbay S发现在葡萄酒的培养基中，酒酒球菌通过脂肪酸含量降低、膜蛋白升高提高了存活率[21]。随着生物演化，酒酒球菌不断调整膜组分耐受了各种胁迫，能够进行苹果酸-乳酸发酵（Malolactic Fementation，MLF），在增强抗逆性和供给能量方面发挥着重要作用，当pH值较低时，MLF能够通过保持细胞内适合的pH值，维持酶的活性；MLF还可以通过物质的转移，由pmf合成ATP，促进细胞的生长。H+-ATP酶也参与了耦合ATP的水解，将质子排出细胞，从而维持质子推动力和细胞内环境稳定，均在抗酸机制中发挥了重要作用[22]。

2　益生菌适应性基因

益生菌基因组的研究有助于揭示益生菌的遗传和代谢机制，目前，微进化遗传变异的机制包括二种：大量数据显示，益生菌能够通过基因水平转移获得一段遗传物质以适应新环境[23]，在获得新基因的同时，会将“无用”基因钝化和消亡[24]；另一种是通过自身基因的变异。自2001年第一株乳酸菌全基因测序完成后，掀起了多个益生菌全基因测序的浪潮，许多研究者发现，改变某个基因后，会对益生菌的环境耐受性和益生菌特性发生改变。

2.1RR基因对内蒙古传统发酵乳制品中分离的L.fermentum MG进行RR基因敲除后的突变体和L.fermentum MG野生型研究发现，突变体耐酸、耐胆盐能力差，粪便中排出的L.fermentum MG活菌数量高，胃部和肠道部内容物和刮取物中的活菌数量低，对果糖和蔗糖的利用能力也显著减弱。该试验结果提示，RR基因在L.fermentum MG野生型中对胃肠道粘附作用、渗透压的改变、酸性环境等外环境的变化、碳水化合物的代谢具有负调控作用[25]。

2.2CCPA基因分解代谢调控蛋白A（catabolite controlprotein A，CCPA）是一种多效调节蛋白，在乳酸乳球菌和植物乳杆菌中的有氧代谢调节中具有关键作用[26]。它能够调节应激反应和有氧代谢，间接或直接调控许多涉及能量和氮代谢基因的转录。Li等研究发现，敲除CCPA基因后，代谢产物、酶活性、压力耐受性、抑菌效果降低[27]。

2.3recA基因Duwat等发现recA基因突变的Lactococcus lactis较野生型菌株对分子氧更敏感。研究人员推测recA基因编码的蛋白可能是通过直接修复损伤的DNA，来达到对抗氧胁迫的目的，也可能是在分子氧造成的DNA损伤修复中发挥间接的调控作用。试验中同时发现，Lactococcus lactis突变株中分子伴侶蛋白的总水平降低[28]。

3　小结

益生菌在食品制造、加工和储存过程中所遇到的压力会降低它们的存活、稳定性和功能性，从而对功能性食品的性能有负面影响。了解威胁条件下益生菌细胞蛋白、水解泵、关键酶等应激改变以及益生菌环境适应性基因有利于进一步挖掘成熟菌株的应用潜力，同时也为筛选具有高胁迫抗性的优良菌株提供了可借鉴的思路。如何利用环境对益生菌的胁迫，仍需我们进一步了解微生物的细胞机制、潜在的耐受性、微生物细胞机制的耐受性以及如何改善压力阻力等。

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S816.7文献标志码：B

0529-6005（2016）07-0121-03

2016-3-25

国家自然科学基金项目（31372413）

潘娜（1991-），女，硕士生，主要从事动物分子病原学研究，E-mail：751579895@qq.com

胡桂学，E-mail：guixue1964@126.com