STAT3，mTOR，ERK1/2磷酸化在非小细胞肺癌中的表达

阿旺旦增　吕广超　赵　慧王凯忠　王　凯　(吉林大学白求恩第一医院胸外科，吉林　长春　3002)



STAT3，mTOR，ERK1/2磷酸化在非小细胞肺癌中的表达

阿旺旦增吕广超赵慧1王凯忠王凯(吉林大学白求恩第一医院胸外科，吉林长春130021)

〔摘要〕目的探讨检测信号传递与转录活化因子( STAT) 3、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白( mTOR)和细胞外信号调节激酶( ERK) 1/2的磷酸化在非小细胞肺癌( NSCLC)中的表达。方法收集49例手术治疗的原发性NSCLC患者的病理组织及19例癌旁正常肺组织。免疫组化检测肺癌组织及癌旁组织中的STAT3，mTOR和ERK1/2蛋白磷酸化的表达，将结果及患者的临床基本信息及TNM分期、病理类型等因素的进行相统计学分析。结果在NSCLC中STAT3、mTOR和ERK1/2的磷酸化高表达。磷酸化的STAT3( p－STAT3)在鳞癌中的表达高于腺癌( P=0．001)。磷酸化的mTOR ( p－mTOR)在存在淋巴结转移的肺癌组织中高表达( P = 0．043)。本实验的肺癌组织中蛋白p－ERK1/2与p－STAT3、p－mTOR之间存在相关性( P = 0．033，P=0．015)。结论NSCLC的发生与STAT3、mTOR和ERK1/2的磷酸化表达有关。p－STAT3在鳞癌发病中意义更大。p－mTOR与淋巴结转移有关。p－ERK1/2与p－mTOR、p－STAT3在NSCLC中的表达存在正相关性。

〔关键词〕非小细胞肺癌; p－STAT3; p－mTOR; p－ERK1/2

1吉林大学白求恩医学院组织学与胚胎学教研室

第一作者:阿旺旦增( 1984－)，男，在读硕士，主要从事肺癌的诊断与治疗研究。

目前非小细胞肺癌( NSCLC)首选手术治疗，但当确诊时75%病人已经失去手术机会，对于一线化疗药物铂类，仅30%患者治疗有效，分子靶向治疗药物已经在临床上取得了较满意的效果。目前研究介导NSCLC增殖的主要通路中较为明确的有两条通路:细胞外调节激酶－丝裂原化蛋白激酶( RAS－ERK/ MAPK)途径;磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白( P13K/AKT/mTOR)路径。这些通路可以使细胞增殖增加，凋亡减少，并使新生血管数目更多，肿瘤的侵袭和转移现象也更加频繁。PI3K/AKT/mTOR信号通路的核心部位的关键蛋白是mTOR，mTOR磷酸化( p－mTOR)可以引起肿瘤细胞快速增殖，促进肿瘤的发生发展〔1〕。

丝裂原的活化蛋白激酶的胞质信号传递路径的终末蛋白激酶是细胞外信号调节激酶( ERK)，它被激活形成p－ERK，在细胞恶性转化过程中起重要作用。信号传递与转录活化因子3 ( STATs)作为一种癌基因，被认定为信号的转导与转录相关激活因子，常过度表达于多种肿瘤细胞中。STAT3的活化构成即为磷酸化的STAT3( p－STAT3)，它能促进细胞的增殖、分化、凋亡等。张一方等〔2〕发现在微管结合蛋白4－间变淋巴瘤激酶( EML4－ALK)融合基因肺癌细胞株中STAT3表达有上调，ERK1/2与AKT及与其相应的磷酸化没有显著的改变，mTOR表达有所上调，磷酸化程度明显升高。本实验旨在探讨STAT3、AKT、mTOR及ERK等蛋白的磷酸化在NSCLC中的表达及其相关性。

1资料与方法

1. 1资料收集原发性NSCLC患者的病理组织49例及癌旁的正常肺组织19例。所有病例均来源于2013年1～8月在我院胸外科予以手术治疗的患者。手术前均未给予化、放疗等抗肿瘤的治疗。癌旁组织由病理科医师诊断为正常肺组织。49 例NSCLC标本中鳞癌29例( 59．2%)，腺癌20例( 40．8%) ;其中男36例，女13例;年龄≥60岁的19例，＜60岁的30例;吸烟患者30例，不吸烟19例;存在淋巴结转移的有22例，无淋巴结转移的病例27例; NSCLC的分期:Ⅰ期23例，Ⅱ期13例，Ⅲ期13例。

1. 2方法

1. 2. 1标本收集本实验收集了49例NSCLC病患的肿瘤组织的石蜡包埋标本。标本切除后20 min内予以收集，甲醛固定，脱水后石蜡包埋，连续切片，每张4 μm。

1. 2. 2免疫组织化学检测实验步骤: ( 1)脱蜡至水:将组织标本放入二甲苯试剂中2遍，5 min/次，不同梯度酒精逐级脱水。( 2)标本用0．01 mol/L的磷酸缓冲盐溶液( PBS)漂洗3遍，5 min/次。( 3)灭活内源性梓根过氧化物酶( HRP) :用3% H2O2去离子水孵育10 min，用PBS冲洗3遍，5 min/次。( 4)抗原修复:切片浸于0．01 mol/L构椽酸盐抗原修复液体中，加热至煮沸10 min，自然冷却即用PBS洗3遍，5 min/次。( 5)擦干切片周围水分，切勿碰触组织。在切片上滴注封闭用山羊血清工作液50 μl，并在室温下孵育30 min，不冲洗，只倒去切片上封闭血清便可。( 6)滴加50 μl的一抗。分别为兔抗人p－STAT3、p－mTOR和p－ERK1/2，予以在4℃冰箱中贮存一晚。( 7)第2天，将从4℃冰箱中取出的过夜切片在室温下复温半小时，后用PBS冲洗3遍，5 min/次。( 8)每张切片在加入1滴生物素化二抗工作液后在室温下孵育半小时，再用PBS冲洗3次，5 min/次。( 9)每张切片在滴加辣根酶标记的链霉卵白素工作液后室温下孵育半小时，后予以PBS溶液冲洗3遍，5 min/次，二氨基联苯胺( DAB)显色:将DAB显色液滴加于盖玻片上，待显微镜下显色结果为阳性时用自来水冲洗盖玻片，终止显色。( 10)用苏木素复染2 min，后用盐酸酒精予以分解，再用自来水冲洗返蓝10 min。( 11)梯度酒精脱水，二甲苯透明，最后用中性树胶封片。

1. 2. 3结果判断在对患者临床资料等信息不知情的前提下，病理科医师独立观察并分析各切片后判定病理结果。染色强度评分标准:无染色0分，淡黄色1分，棕黄色2分，褐色计为3分;

1. 3统计学方法应用SPSS19．0统计学分析软件进行χ2检验。

2结果

2. 1 STAT、ERK1/2、mTOR在NSCLC组织和癌旁正常组织中的表达p－STAT3免疫组化阳性反应物为棕黄色小颗粒，主要存在于细胞核，p－ERK1/2阳性定位于细胞质和细胞核，pmTOR为粗细不一棕黄色颗粒，主要染色位于细胞质。免疫组织化学结果显示，STAT3、ERK1/2、mTOR磷酸化在NSCLC组织的表达〔35例( 71．3%)、4例( 83．7%)、37例( 75．5%)〕明显高于癌旁正常组织中的表达〔3例( 15．8%)、5例( 26．3%)、3例( 15．8%)〕( P＜0．001)。

2. 2 STAT蛋白在NSCLC中的磷酸化表达男性的表达率为75．0%( 27/36)，女性为61．5%( 8/13)，≥60岁患者中表达率为78．9%( 15/19)，＜60岁为66．7%( 20/30)，吸烟患者阳性率为76．7%( 23/30)，不吸烟患者中为63．2%( 12/19)，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各期中表达率分别为69．6%，84．6%和61．5%，在存在淋巴结转移的肺癌中表达率为68．2%( 15/22)，在无淋巴结转移的肺癌中为74．1%( 20/27)，以上相关因素的比较中未见明显统计学差别( P＞0．05)。p－STAT3在肺鳞状细胞癌中的表达率为89．7%( 26/29)，明显高于在腺癌中的表达率〔45．0%( 9/20)〕( P=0．001)。

2. 3 ERK1/2蛋白在NSCLC中的磷酸化表达在男性中表达率为80．6%( 29/36)，女性中为92．3%( 12/13)，≥60岁患者中表达率为89．5%( 17/19)，＜60岁为80．0%( 24/30)，吸烟患者阳性率为83．3%( 25/30)，不吸烟患者中为84．2%( 16/19)，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各期中表达率分别为82．6%，100．0%和69．2%，在存在淋巴结转移的肺癌中表达率为81．8%( 18/22)，在无淋巴结转移的肺癌中为85．2%( 23/27)，在鳞癌中的表达率为86．2% ( 25/29)，在腺癌中为80．0%( 16/20)，以上相关因素的比较中未见明显统计学差别( P＞0．05)。

2. 4 mTOR蛋白在NSCLC中的磷酸化表达在男性中表达率为72．2%( 26/36)，女性中为84．6%( 11/13)，≥60岁患者中表达率为73．7%( 14/19)，＜60岁为76．7%( 23/30)，吸烟患者阳性率为73．3%( 22/30)，不吸烟患者中为78．9%( 15/19)，Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期中表达率分别为69．6%，76．9%和84．6%，在鳞癌中的表达率为79．3%( 23/29)，在腺癌中为70．0%( 14/20)，以上相关因素的比较中未见明显统计学差别( P＞0．05)。在存在淋巴结转移的肺癌中表达率为90．9%( 20/22)，明显高于在无淋巴结转移的肺癌中的63．0%( 17/27) ( P=0．043)。

2. 5磷酸化STAT3和ERK1/2、mTOR在肺癌中表达的关系

在p－STAT3阳性表达的35例肺癌组织标本中p－ERK1/2有32例阳性表达，在p－STAT3阴性表达的14例肺癌组织标本中p－ERK1/2有5例阴性表达，两者存在正相关性( P= 0．033)。在p－mTOR阳性表达的37例肺癌组织标本中p－ERK1/2有34例阳性表达，在p－mTOR阴性表达的12例肺癌组织标本中p－ERK1/2有5例阴性表达，两者存在正相关性( P=0．015)。

3讨论

肺癌是当今发生率与致死率最高的恶性肿瘤。我国卫生部2006年统计资料显示，城市居民死亡原因排在首位的是肺癌，在所有癌症中死亡率排第一位，肺癌在农村居民的死亡原因中也升至第三位〔3〕。有研究认为NSCLC组织中STAT3表达显著增高，且肿瘤对该通路存在依赖性，但也有研究认为该通道在NSCLC中不活化。根据HPRD数据库检索到的Cytoscape制作的蛋白质相互作用网络，本文发现，STAT3与MAPK家族、mTOR等蛋白存在相互作用。张一方等〔2〕发现STAT3在EML4－ALK融合基因肺癌细胞株中表达上调，mTOR出现上调，磷酸化水平显著提高。STAT3已被确认为是一种癌基因，在肿瘤的发生和进展过程中发挥重要功能，因此对于STAT3的进一步研究分析十分重要。本实验结果提示在NSCLC中STAT3、mTOR，和ERK1/2的磷酸化高表达。p－STAT3在鳞癌中的表达高于腺癌。p－mTOR在存在淋巴结转移的肺癌组织中高表达，与肺癌的侵袭性、转移能力、预后可能有关。p－STAT3与p－ERK1/2，p－ERK1/2与p－mTOR在NSCLC中的表达存在正相关性，或许是联合使用抑制剂治疗肺癌的一个方向。但是本次实验只是从蛋白水平观察了STAT3、ERK1/2、mTOR与NSCLC的关系，对于他们之间的具体调控机制，尚未进行基因水平的研究，仍需进一步研究，为了解NSCLC及有效地进行NSCLC的靶向治疗提供了新的思路和依据。

STATs是在研究干扰素( IFN)信号转导通路时发现的信号转导与转录激活因子，是一类能与DNA结合的蛋白家族〔2〕。目前为止，与肿瘤发生、发展关系比较密切的STATs家族成员包括STAT1、STAT3及STAT5，其中以STAT3最为活跃。STAT3与肺癌的相关性是本次试验要解决的问题。STAT3的活化体现在羧基端705位酪氨酸的磷酸化位点被磷酸化〔4〕。磷酸化的STAT3单体通过与另外一个STAT3分子磷酸化的酪氨酸残基彼此作用形成二聚体，而后进入细胞核〔5〕。后于特异DNA结合位点作用，直接或间接调节凋亡抑制基因，从而调控细胞增殖和细胞凋亡。

Ras/Raf/MEK/ERK途径是最具代表性的MAPK信号传导途径之一，在NSCLC中起重要作用。MAPK信号系统是一组非常保守的丝氨酸(苏氨酸)双重磷酸化蛋白激酶家族，在信号传递的过程中占据着相当重要的地位。ERK是调控细胞增殖的重要途径，在细胞分化发育、周期循环调控、胞间功能同步等多种生理病理过程中发挥作用。ERK1/2活化的形式即是p－ERK1/2。p－ERK1/2进入细胞核作用于c－jun、核转录因子( NF－κB)、Elk－1、c－fos、c－myc等转录因子，可磷酸化核转录因子等多种底物，调节相关基因的转录，并在细胞恶性化过程中起重要作用〔6〕。Mi等〔7〕研究认为P13K/AKT/mTOR信号通路和MAPK/ERK通路之间或存在以下联系，抑制mTOR将会通过负反馈方式激活MAPK/ERK通路。

mTOR属于PI3K蛋白激酶类家族，是一种丝/苏氨酸蛋白激酶。其对于细胞的调控作用通过PI3K/AKT/mTOR途径来实现〔8〕。mTOR活化状态即p－mTOR，在NSCLC中mTOR磷酸化程度随恶性肿瘤进展增加。本实验说明mTOR的磷酸化表达与NSCLC的侵袭性、转移能力有密切关系，对肺癌患者的预后有影响。这在脑胶质瘤、乳腺癌、卵巢癌中早已有报道。有研究〔9〕显示在74%的NSCLC中发现磷酸化或活化的mTOR，表明mTOR抑制剂与传统放、化疗联合应用在肺癌治疗中，可能会显示出更明确的疗效〔10〕。

4参考文献

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2张一方，吴一龙．EML4－ALK融合基因在非小细胞肺癌信号转导中的作用〔J〕．癌症进展，2010; 8( 6) : 530－7．

3赵亚力，李琦，韩为东．肺癌的表皮生长因子受体分子靶向治疗与基因突变〔J〕．生物技术通讯，2007; 18( 6) : 1007－9．

4王炯铁，姜斌，刘峰．STAT3、p－STAT3、VEGF和bFGF在非小细胞肺癌中的表达〔J〕．上海交通大学学报(医学版)，2009; 29( 12) : 1450－4．

5 Levy DE，Darnell JE Jr．Stats: transcriptional control and biological impact 〔J〕．Nat Rev Mol Cell Biol，2002; 3( 9) : 651－62．

6谷艳娇，包翠芬，魏嘉，等．ERK1/2和p－ERK1/2在肺癌组织中的表达及意义〔J〕．中国组织化学与细胞学杂志，2009; 18( 3) : 328－32．

7 Mi R，Ma J，Zhang D，et al．Efficacy of combined inhibition of mTOR and ERK/MAPK signaling pathways in treating a tuberous sclerosis complex cell model〔J〕．J Genet Genomics，2009; 36( 6) : 355－61．

8郑鹏生，冀静．mTOR信号通路与肿瘤的研究进展〔J〕．西安交通大学学报(医学版)，2010; 31( 1) : 1－9．

9 Marinov M，Fischer B，Arcaro A．Targeting mTOR signaling in lung cancer〔J〕．Crit Rev Oncol Hematol，2007; 63( 2) : 172－82．

10祁慧薇．P13K/Akt/mTOR信号转导通路与非小细胞肺癌〔J〕．中国肺癌杂志; 2010; 13( 12) : 1149－54．

〔2015－05－16修回〕

(编辑袁左鸣/滕欣航)

通讯作者:王凯忠( 1968－)，男，副教授，硕士生导师，主要从事肺癌的诊断与治疗研究。

〔中图分类号〕R73

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202( 2016) 02-0354-03;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2016. 02. 046