反向间接血凝试验在畜禽病毒疾病诊断中的应用进展

庄金秋，梅建国，王玉茂，谢金文，莫玲，沈志强

（1.山东省滨州畜牧兽医研究院山东滨州256600；2.滨州贝尔凯瑞生物技术有限公司山东滨州256600）



反向间接血凝试验在畜禽病毒疾病诊断中的应用进展

庄金秋1，2，梅建国1，2，王玉茂1，谢金文1，莫玲1，沈志强1

（1.山东省滨州畜牧兽医研究院山东滨州256600；2.滨州贝尔凯瑞生物技术有限公司山东滨州256600）

摘要：反向间接血凝试验（Reverse indirect hemagglutination test，RIHA）是一种简单实用的实验室检测技术，已广泛应用于人类及动物疾病的诊断及临床检测。本文概述了RIHA在动物病毒病诊断方面的应用进展，以期为兽医临床科技工作者更好地应用该法诊断疾病提供参考。

关键词：反向间接血凝试验；诊断；应用

反向间接血凝试验（Reverse indirect hemagglutination test，RIHA）是以红细胞为载体的间接凝集试验，即用已知的抗体致敏红细胞，然后与样品在适宜的条件下反应，如样品中含有目的抗原，则抗原抗体发生特异性结合，红细胞会随反应的发生出现肉眼可见的凝集现象。

1畜禽病毒病

1.1猪病

RIHA是我国鉴定口蹄疫病毒（Foot and mouth disease virus，FMDV）的行业标准，该方法能够快速对FMDV进行初步鉴定。用口蹄疫A、O、C型的豚鼠高免血清与猪水疱病病毒（Swine vesicular diseasevirus，SVDV）高免血清抗体球蛋白致敏，用1%戊二醛、甲醛固定的绵羊红细胞，制备抗体红细胞与不同稀释的待检抗原，进行RIHA试验，可在2～7 h内快速区别诊断猪水疱病和口蹄疫。何永强等（1999）通过单克隆抗体斑点酶联免疫吸附试验（McAb Dot-ELISA）和RIHA分别对猪FMDV和SVDV检测比较，结果表明，McAb Dot-ELISA特异性强，快速简便，比RIHA更为敏感、稳定和直观。RIHA虽然灵敏度较高，但个别被检抗原可能在低稀释度孔内出现非特异性凝集。用猪瘟病毒（Clssical swine fever virus，CSFV）免疫血清提取IgG并且纯化后，致敏绵羊红细胞，建立RIHA方法，可用于检测脾脏、淋巴结、扁桃体等病原较集中存在的组织中的CSFV抗原。不足之处在于用于处理组织病料的方法有差异，所以易对组织中的血细胞造成干扰，使得非特异性凝集出现而难以判定结果。吴平等（1991）通过单抗致敏的绵羊红细胞建立RIHA试验来检测猪伪狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV），结果与血清中和试验（SN）的符合率为94.4%，并认为RIHA可作为一种PRV的常规诊断技术。应用猪轮状病毒（Rotavirus，RV）IgG，致敏经双醛一次固定的绵羊红细胞，可直接检查样品中RV。何孔旺等（1989）认为RIHA试验能在1.5～2 h内直接从粪便样品中检测出RV抗原。

猪日本乙型脑炎又称流行性乙型脑炎，是由日本脑炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）引起的一种急性、人兽共患传染病。应用RIHA试验检查，对感染的鼠脑检测敏感性可达1∶1 000以上，具有较高的特异性和检出率，可在3 h得到结果。黄志鑫等（1992）采集大约、长白、杜洛克和汉普夏等品种猪德血清87份，应用RIHA试验检测猪源乙型肝炎病毒抗原（HBsAg），阳性3份，阳性率3.4%，具有较好的特异性和敏感性。RIHA试验在猪病诊断方面得到了较为广泛的应用。

1.2羊病

在羊病方面，国内外已有研究人员成功建立了RIHA试验检测山羊痘病毒（Goatpox virus，GPV），不仅可以检测患病羊病料组织中的GPV，而且可以检测感染细胞培养物中的GPV。用致敏的绵羊红细胞进行山羊痘的诊断，其中绵羊红细胞可用不同的方法致敏。Rao等（1997）试验证明应用戊二醛或丹宁酸致敏绵羊红细胞，在绵羊痘的诊断中取得较好的效果。王开功等（2003）、陈伯祥等（2015）以兔抗山羊痘病毒IgG致敏绵羊红细胞，来检测GPV抗原，并通过对贵州省疫区现场采集山羊痘待检抗原的检测，结果表明，RIHA方法较之琼脂扩散试验（AGP）要敏感，表明其建立的方法可用于山羊痘的诊断和流行病学检测，是一种灵敏、操作简单、快速的检测方法。羊传染性脓疱口炎是由羊传染性脓疱病毒（Contagious ecthyma virus，CEV）引起的一种人畜共患的、接触性的、嗜上皮性传染病。陈燕军（1982）用RIHA试验对羊CEV进行了研究，证实了该方法的可行性和特异性。

1.3禽病

在禽病方面，赵新柳（1987）应用RIHA检测鸡传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus，IBV），结果表明，用纯度过高的抗原制备高免血清，致敏红细胞后检测IBV，敏感度反而下降；而用PEG浓缩病料后，IBV检出率明显提高。毕玉霞（2007）认为RIHA可用于检测IBV抗原，但可靠性不及SN。樊晓京等（1997）应用反向间接血凝抑制试验（RPHI）检测鸡传染性法氏囊病（Infectious bursal disease，IBD）血清抗体，得到了满意的效果。用RPHI 和AGP两种方法同时测定67份鸡血清，其中AGP检出22份阳性，检出率为32.8%；RPHI检出62份阳性，检出率为92.5%。在AGP阳性的22份血清中，RPHI亦均为阳性，而AGP阴性的45份血清中，RPHI检出40份阳性。RPHI的检出率比AGP高约60%。Deng等（1984）的研究报道证实，RIHA法检测鸭瘟病毒（Duck Plague Virus）3h可判读结果，操作简便，不需昂贵的设备试剂，致敏细胞可长期保存，但敏感性较低，不适合少量DPV检测。该方法对于DPV的定性检测来说，感染病鸭大量排毒而使送检组织存在大量病毒，RIHA足够敏感，具有实用价值。徐为燕等（1981）应用RIHA检测鹅胚尿囊液中的鹅细小病毒（Goose parvovirus，GPV），郭玉璞等（1994）对此法做了进一步完善。孙怀昌等（1989）将提纯抗病毒单抗IgG致敏鹅或绵羊红细胞建立了RIHA试验，并对提纯抗GPV抗原进行了检测，结果显示最低检出浓度分别为34 ng/mL和26 ng/mL；对试验感染鹅胚尿囊液、发病雏鹅组织及粪便的检出率分别为 100%（10/10）、81%（27/33）和 91% （21/23）；结果还显示该方法可以对番鸭细小病毒（MDPV）、鸡新城疫病毒（NDV）、猪细小病毒（PPV）及犬细小病毒（CPV）进行鉴别诊断。该方法相对简单，适用于大批量检测GPV感染样品。

2前景与展望

RIHA试验可用于检测病原体的可溶性抗原，也可用于检测各种蛋白质成分。红细胞最常用的为绵羊、家兔、鸡的红细胞及O凝型人红细胞。新鲜红细胞能吸附多糖类抗原，但吸附蛋白质抗原或抗体的能力较差。致敏的新鲜红细胞保存时间短，且易变脆、溶血和污染，只能使用2～3 d。为此一般在致敏前先将红细胞醛化，醛化红细胞具有较强的吸附蛋白质抗原或抗体的能力，可长期保存而不溶血。RIHA所需设备简单、操作简便、只需在V型96孔微量反应板上进行，结果易判定，特异性和重复性良好，有很好的实用价值，3 h内即可作出诊断。由于RIHA具有特异性强，灵敏度高和便于操作等优点，适用于临床诊断和少量样品的检测，易于在动物疾病诊断、生物制品研制和广大基层养殖中推广应用，具有广泛的应用前景。（编辑：赵晓松）

doi：10.3969/j.issn.1008-4754.2016.6.046

基金项目：山东省重点研发计划项目（2015GSF121027）；山东省现代农业产业技术体系毛皮动物创新团队项目（SDAIT-18-011-15）。

作者简介：庄金秋（1978-），女，山东潍坊人，兽医硕士，副研究员，主要从事细胞培养和动物用病毒疫苗研制。E-mail：zhuangjinqiu2003@163.com

Progress on the Application of Reverse Indirect Hemagglutination Test in the Diagnosis of Animal Virus Diseases

Zhuang Jinqiu1，2，Mei Jianguo1，2，Wang Yumao1，Xie Jinwen1，Mo Ling1，Shen Zhiqiang1
（1.Shandong Binzhou Animal Science&Veterinary Medicine Academy，Binzhou，Shandong Province，256600；2.Bin Zhou Bio-carrier Biotechnology CO.，LTD，Binzhou，Shandong Province，256600）

Abstract：Reverse indirect hemagglutination test（RIHA）is a simple and practical laboratory testing technology，which has been widely used in the field of human and animal diseases and clinical detection.It was summarized that the Progress on the Application of RIHA in the diagnosis of animal virus diseases，in order to provide the reference for clinical veterinary science and technology workers.

Key words：Reverse indirect hemagglutination test；Diagnosis；Application