314例中国胃癌患者K-ras基因的突变状态分析*

基金项目:上海市科委课题(13DZ2293100)。



314例中国胃癌患者K-ras基因的突变状态分析*

*基金项目:上海市科委课题(13DZ2293100)。

彭南求，赵新泰△

(上海赛安生物医药科技有限公司，上海 201900)

摘要:目的分析胃癌患者K-ras基因突变状态，以期为胃癌患者的个体化治疗提供指导。方法采用嵌套和COLD-PCR的方法分析314例胃癌患者K-ras基因突变状态。结果在314例胃癌患者中，K-ras基因总体突变率是7.32%。19例血浆标本的突变率为0%。295例组织标本的突变率为7.80%。突变类型包括G12D、G13D、G12V，两种不同标本之间K-ras基因的突变率并无显著差异(P=0.206 1)；221例男性患者的突变率为6.79%，突变类型包括G12D、G13D，93例女性患者的突变率为8.60%，突变类型包括G12D、G13D、G12V，不同性别之间K-ras基因的突变率之间无显著差异(P=0.573 1)；45例青年人患者的突变率为6.67%，突变类型包括G12D、G13D，127例中年人患者的突变率为7.87%，突变类型包括G12D、G13D、G12V，142例老年人患者的突变率为7.04%，突变类型包括G12D、G13D，不同年龄患者K-ras基因的突变率之间无显著差异(P=0.995 3)。结论314例胃癌患者K-ras基因突变率是7.32%，突变类型主要为G12D、G13D，K-ras基因在不同标本类型、不同性别、不同年龄之间的突变率并无显著差异。

关键词:胃癌；K-ras；基因突变状态

癌症是一种高发病率、高病死率的全球性疾病，仅在2008年就造成760万人死亡。过去的10年中，癌症的病死率呈现降低的趋势，大约118万癌症患者得到了有效的救治[1-2]。胃癌是最常见的消化道肿瘤之一，其发病率和病死率一直居高不下，虽然手术可以根治，但术后的复发转移严重影响患者的生存，由于缺乏对晚期胃癌及复发型胃癌的有效治疗方案，目前胃癌的病死率居全世界恶性肿瘤的第2位[3]，对胃癌的早发现、早治疗是提高临床疗效和降低病死率的有效方法[4]。K-ras基因编码的p21-ras蛋白位于质膜上转导细胞生长与分化的信号。K-ras突变主要发生在12、13和61编码子上，这些突变造成K-ras激活[5]。K-ras突变与患者缺乏对EGFR单抗的反应有关,突变者不适用西妥昔单抗治疗[6]。NCCN 2010年临床指南中推荐：在接受西妥昔单抗治疗前，进行K-ras基因突变检测，确定是否接受该靶向治疗。

本研究采用嵌套和COLD-PCR方法研究了314例中国人胃癌肿瘤血液标本中K-ras基因的突变状态，同时比较了不同标本、性别和年龄群体中K-ras基因突变频率的差异，以期能为西妥昔单抗药物的使用提供参考依据。

1材料与方法

1.1标本来源本研究使用的临床标本来自全国上百家三级医院，包括19例血浆标本和295例组织标本。所有参与本研究的胃癌患者或其家属均签署过授权给上海赛安生物医药科技有限公司进行K-ras基因检测的知情许可同意书。

1.2仪器与试剂试验使用的Pfu酶购自上海申能博彩生物科技有限公司，dNTP购自上海申能博彩生物科技有限公司，DNA提取试剂盒购自Axygen Scientific Inc，所使用的PCR仪则购自杭州博日科技有限公司，离心机购自湘仪离心机仪器有限公司，PCR产物序列测定由上海鼎安生物科技有限公司完成。

1.3方法

1.3.1基因组DNA的提取按照试剂盒说明书进行。

1.3.2COLD-PCR-测序法检测K-ras基因突变状态用primer 5进行引物设计，由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成，嵌套和COLD-PCR-测序法被用于检测K-ras基因的突变。

第1步 PCR扩增，常规PCR方法被用于扩增465 bp的大片段。所用引物为：正向， 5′-GTC GAT GGA GGA GTT TGT AAA TGA AGT-3′和反向 5′-TTC AGA TAA CTT AAC TTT CAG CAT AAT TAT CTT G-3′。10 μL PCR反应体系，包括：0.25 mmoL的dNTP、0.5 mmoL的引物、0.5单位的Taq DNA聚合酶和10 ng的模板DNA。 PCR程序如下：95 ℃预变性3 min，接着进行32个扩增循环：94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，72 ℃ 5 min。

第2步 COLD-PCR COLD-PCR方法用于扩增155 bp的小片段。所用引物为：正向，5′-GTC ACA TTT TCA TTA TTT TTA TTA TAA GG-3′和反向5′-TTT ACC TCT ATT GTT GGA TCA TAT TC-3′。用50 μL的PCR反应体系，包括：0.25mmoL的dNTP、0.5 μmoL的引物、0.5单位的Taq DNA聚合酶和1 μL的大片段PCR产物。 PCR程序如下：95 ℃预变性3 min，先进行40个扩增循环：80 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，随后进行15个扩增循环：94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，72 ℃，5 min。

第3步 PCR产物纯化测序，由上海鼎安生物科技有限公司完成。

1.4统计学处理采用SPSS20.0软件进行数据处理及统计学分析，计数资料以例数或百分率表示，结果比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1PCR产物测序结果采用COLD-PCR-测序的方法，检测K-ras基因突变状态，其代表性结果如图1所示。对COLD-PCR产物测序的代表性图谱，指示胃癌患者K-ras基因第12位密码子由GGT突变为GAT。

图1　　COLD-PCR产物测序的代表性图谱

2.2不同标本类型胃癌患者K-ras基因的突变情况本研究检测了314例胃癌患者，K-ras基因总体突变率是7.32%。包括19例血浆标本和295例组织标本，血浆标本的突变率为0%，组织标本的突变率为7.80%，突变类型包括G12D、G13D、G12V，两种不同标本之间K-ras基因的突变率并无显著差异(P=0.206 1)，详见表1。

2.3不同性别胃癌患者K-ras基因的突变情况K-ras基因在221例男性患者的突变率为6.79%，突变类型包括G12D、G13D，在93例女性患者的突变率为8.60%，突变类型包括G12D、G13D、G12V，不同性别之间K-ras基因的突变率之间无显著差异(P=0.573 1)，详见表1。

2.4不同年龄群体胃癌患者K-ras基因的突变情况K-ras基因在45例青年人患者的突变率为6.67%，突变类型包括G12D、G13D，127例中年人患者的突变率为7.87%，突变类型包括G12D、G13D、G12V，142例老年人患者的突变率为7.04%，突变类型包括G12D、G13D，不同年龄患者K-ras基因的突变率之间无显著差异(P=0.995 3)，详见表1。

表1　　胃癌患者不同标本类型、性别、年龄群体中K-ras基因的突变频率

-：无数据。

3讨论

哺乳动物ras基因家族包括H-ras、K-ras、N-ras基因，分别编码H-ras、K-ras、N-ras蛋白，它们具有相似的结构和功能。Ras蛋白位于细胞膜内侧，将EGFR的信号转导给促分裂原活化蛋白激酶(MAPKs)，从而控制细胞的生长、增殖、运动，以及转移和血管生成[7]。K-ras基因通常在第12、13和61位密码子上发生点突变，这些突变常常激活K-ras癌基因[8]。K-ras基因的突变状态和靶向EGFR单克隆抗体的治疗效果相关，K-ras基因突变的患者，不适合爱必妥治疗[9]。

多种方法被用于改进检测的灵敏度，如变性高效液相色谱(DHPLC)[10]、嵌套等位基因特异性阻滞剂(ASB-)PCR[11]、PCR单链构象多态性(SSCP)[12]、限制性片段长度多态性(RFLP)[13]、以及扩增阻滞突变系统(ARMS)等[14]。由于对设备的要求简单，且灵敏度高，COLD-PCR(在较低的变性温度-PCR)是当前最广泛使用的方法，它能富集不同的DNA片段，改进检测的灵敏度[15-16]。

虽然手术是根治胃癌患者的最好方法，但由于很多患者发现时已经是胃癌晚期，因此，化疗药物的使用就显得很重要，其中多西他赛就是典型，它通过阻断细胞分裂，达到抑制细胞增殖的目的[17]，从而提高患者的无进展期和生存期，改善生活质量。术后复发转移是导致治疗失败的重要原因，现在已经有很多标志物可以预测复发情况的发生，比如SOX-2、Beta-catenin等，通过检测它们的表达，可以较好地预测胃癌患者术后的复发转移[18-19]。

K-ras基因突变虽然不能作为胃癌患者的个体化治疗指标，但是个体化医疗是新兴的治疗癌症方法，它结合了分子生物学的手段，能更好地针对每个人的情况采取量体裁衣的治疗，从而缩短治疗的时间、提高生存期、改善患者的生活质量。

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·论著·

Analysis of K-ras gene mutation status in 314 Chinese patients with gastric cancer*

PengNanqiu,ZhaoXintai△

(ShanghaiShinesPharmaceuticalsCo.,Ltd.,Shanghai201900,China)

Abstract:ObjectiveTo analyze the mutation status of K-ras gene in the patients with gastric cancer to provide the guidance for the personalized therapy of gastric cancer.MethodsThe nested and Cold-PCR were adopted to analyze the K-ras gene mutation status in 314 cases of gastric cancer.ResultsIn 314 cases of gastric cancer,the total mutation rate of K-ras gene was 7.32%.The mutation rate was 0% in 19 plasma samples and 7.80% in 295 tissue samples.The types of mutation included G12D,G13D,G12V,the mutation rate of K-ras gene had no statistically significant difference between the two kinds of different samples (P=0.206 1);the mutation rate was 6.79% in 221 male patients,the types of mutation included G12D,G13D,the mutation frequency is 8.60% in 221 female patients,the types of mutation include G12D,G13D,G12V,the mutation rate of K-ras gene had no statistically significant difference between different genders (P=0.573 1);the mutation rate was 6.67% in 45 youth patients,the types of mutation included G12D,G13D,the mutation rate was 7.87% in 127 middle age patients,the types of mutation included G12D,G13D,G12V,the mutation rate was 7.04% in 142 old age patients,the types of mutation included G12D,G13D,there was no statistically significant difference among different age patients (P=0.995 3).ConclusionThe mutation rate of K-ras gene is 7.32% in 314 cases of gastric cancer,the main mutation types include G12D and G13D,and the mutation rate of K-ras gene has no significant difference among different samples,between different sexes and among different ages.

Key words:gastric cancer;K-ras;gene mutation status

收稿日期：(2015-07-19)

文献标识码：

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2015.24.003A

文章编号：1673-4130(2015)24-3514-03

通讯作者△，E-mail:zhaoxintai@shineschina.com.

作者简介：彭南求，男，主管检验技师，主要从事肿瘤个体化医疗工作。