共轭亚油酸异构体对人乳腺癌MCF-7细胞增殖的抑制和促凋亡作用

孙丽婷，刘 萍，李加肖，李响敏，李海星，刘晓华

（1.南昌大学中德联合研究院，食品科学与技术国家重点实验室，江西南昌 330047；2.扬州市第一人民医院，江苏扬州 225009）

共轭亚油酸异构体对人乳腺癌MCF-7细胞增殖的抑制和促凋亡作用

孙丽婷1，刘 萍2，李加肖1，李响敏1，李海星1，刘晓华1

（1.南昌大学中德联合研究院，食品科学与技术国家重点实验室，江西南昌 330047；2.扬州市第一人民医院，江苏扬州 225009）

共轭亚油酸；异构体；MCF-7；人乳腺癌；细胞增殖；抑制；促凋亡

共轭亚油酸（conjugated linoleic acid，CLA）是一组具18个碳原子，含有共轭双键的多不饱和脂肪酸，是必需脂肪酸亚油酸的同分异构体。近年来大量动物试验表明，CLA具有抗癌［1］、抗动脉粥样硬化［2］、降低脂肪沉积［3］等重要生理功能。虽然目前国内外关于CLA对癌细胞凋亡的影响已做了大量研究工作，但还未见t9，t11-CLA单体抗癌活性的报道。本文通过比较3种CLA异构体——c9，t11-CLA；t10，c12-CLA；t9，t11-CLA对乳腺癌细胞MCF-7细胞生长、凋亡及细胞周期的影响，以筛选出更有效抗癌的CLA异构体。

1 材料

1.1 试剂 人乳腺癌细胞MCF-7：北京市肿瘤研究所；t9，t11-CLA（纯度98％）：Matreya，USA；c9，t11-CLA，t10，c12-CLA（纯度98％）：南昌华兴生物科技有限公司。

DMEM培养液、0.25％胰蛋白酶-EDTA消化液、MTT、 Hoechst 33258荧光染料：北京索莱宝科技有限公司；胎牛血清：美国Hyclone公司；DNA含量检测试剂盒：南京凯基生物科技发展有限公司。

1.2 仪器 MCO-18AIC（UV）CO2培养箱：（日本）三洋电机株式会社；BD FACS Calibur流式细胞仪：美国PE公司；酶标仪：美国Molecular Devices；倒置荧光显微镜：重庆光学仪器厂。

2 方法

2.1 人乳腺癌MCF-7细胞培养 配制含10％胎牛血清、1 ×105U·L－1青霉素、100 mg·L－1链霉素的DMEM全培养基，在5％CO2和37℃条件下培养人乳腺癌MCF-7细胞，每隔24～48 h更换培养基，常规消化传代，取对数生长期细胞进行实验。

2.2 CLA溶液的制备 配制浓度为200 mmol·L－1的CLA储备液，保存于－20℃。用前将其用含10％胎牛血清的DMEM培养液稀释，至终浓度分别为25、50、100和200 μmol·L－1。

2.3 MTT法测定MCF-7细胞增殖的抑制活性 取对数生长期的MCF-7细胞，接种于96孔板，每孔200 μL（1×104细胞/孔），培养过夜，按不同浓度（25、50、100、200 μmol·L－1）CLA进行药物干预24 h。加入MTT（5 g·L－1）20 μL每孔，培养箱中保温4 h后，弃孔内培养液，加DMSO 200 μL每孔，置摇床上低速振荡15 min，用酶标仪检测各组细胞在490 nm波长处的OD值［4］。另设阴性对照组和调零孔（不加细胞）。每组设5个复孔，实验重复3次。

细胞抑制率/％＝1－［（药物组OD值－调零孔OD值）/（对照孔OD值－调零孔OD值）×100％］

2.4 荧光染色观察MCF-7细胞凋亡 MCF-7细胞接种于12孔培养板，每孔600 μL（5.0×104细胞·孔－1），细胞培养过夜后加入不同浓度（0、50、100、200 μmol·L－1）的CLA，48 h后，PBS洗涤细胞，加10 mg·L－1Hoechst 33258荧光染料染色，37℃孵育8 min，PBS洗涤两次，超净工作台中避光风干后进行观察。

2.5 FCM检测MCF-7细胞凋亡和细胞周期 取对数生长期MCF-7细胞，接种于6孔培养板（每孔3×105细胞），培养过夜后分别加入终浓度为50、100 μmol·L－1的CLA，48 h后，PBS洗涤细胞，将细胞制成单细胞悬液，收集细胞。参照DNA含量检测试剂盒说明书处理细胞，用流式细胞仪对样品进行凋亡和周期分析。每组设3个复孔，实验重复3次。

2.6 统计学处理 使用SPSS统计软件，采用One-way ANOVE法对数据进行差异显著性分析（P＜0.05）。

3 结果

3.1 CLA对MCF-7细胞增殖的抑制率 3种CLA单体随着作用浓度的增加，抑制作用均增强。在≤50 μmol·L－1的浓度时，t10，c12-CLA对细胞的抑制作用强于c9，t11-CLA；在≥100 μmol·L－1时，c9，t11-CLA对细胞的抑制作用强于t10，c12-CLA。t9，t11-CLA在不同浓度下的增殖抑制率均高于其他2种CLA单体（P＜0.05）。

3.2 荧光显微镜下观察MCF-7细胞凋亡 对照组的细胞核呈弥漫性均匀荧光，荧光较弱，实验组随CLA浓度增加可见明显的凋亡细胞核：细胞核体积变小，皱缩，呈致密浓染的颗粒块状荧光。t9，t11-CLA组在50 μmol·L－1的浓度时就表现出明显的促进MCF-7细胞凋亡的作用。

3.3 用流式细胞仪测定凋亡率及细胞周期 3种CLA异构体在50和100 μmol·L－1浓度下对MCF-7细胞均产生较强的促凋亡作用。其中t9，t11-CLA对MCF-7细胞的凋亡率分别为28.34％和34.66％，与对照组相比，分别增加了24.93％和31.25％，细胞凋亡率呈明显提高（P＜0.05）。

随CLA浓度增加，MCF-7细胞G0/G1期缩短，S期延长，由此可见，CLA可将细胞阻滞在S期。50和100 μmol·L－1的t9，t11-CLA组的G0/G1期细胞比率分别下降至53.17％ 和42.72％，S期延长的幅度分别为26.96％和32.63％，呈明显增加（P＜0.05）。

4 讨论

CLA是食物中的天然成分，对人体无毒副作用。本研究中，应用人乳腺癌MCF-7细胞为体外模型，用MTT法、荧光染色及流式细胞术对c9，t11-CLA，t10，c12-CLA和t9，t11-CLA 3种单体的抗乳腺癌活性及促进癌细胞凋亡能力进行了研究。结果发现，3种CLA异构体均可抑制MCF-7细胞增殖并促进细胞凋亡，t9，t11-CLA在抑制MCF-7细胞增殖、促进细胞凋亡方面是最有效的CLA单体。细胞周期分析结果表明，随CLA浓度增加，MCF-7细胞G0/G1期缩短，S期延长，表明CLA可将细胞阻滞在S期，对细胞增殖有明显的抑制作用。因此，CLA的抗癌作用可能是通过影响细胞周期进程，进而抑制细胞分裂增殖和诱导凋亡。本研究为今后乳腺癌的预防与治疗研究提供了实验依据。

（致谢：本实验在中德联合研究院和食品科学与技术国家重点实验室完成，衷心感谢刘晓华老师、刘萍老师、李响敏老师、李海星老师对我实验的指导与帮助，感谢李加肖师妹对我实验的帮助！）

［1］ Rakib M A，Lee W S，Kim G S，et al.Antiproliferative action of conjugated linoleic acid on human MCF-7 breast cancer cells medi-ated by enhancement of gap junctional intercellular communication through inactivation of NF-κB［J］.Evid Based Complement Alter-nat Med，2013，11（33）：1－12.

［2］ Eftekhari M，Aliasghari F，Beigi M A，et al.The effect of conju-gated linoleic acids and omega-3 fatty acids supplementation on lipid profile in atherosclerosis［J］.Adv Biomed Res，2014，3（1）：15－9.

［3］ Carvalho R F，Uehara S K，Rosa G.Microencapsulated conjuga-ted linoleic acid associated with hypocaloric diet reduces body fat in sedentary women with metabolic syndrome［J］.Vasc Health Risk Manag，2012，8：661－7.

［4］ 木合布力·阿布力孜，王永波，徐方野，阿布力孜·阿布杜拉.异甘草素和3-甲氧基异甘草素对人肝癌Bel-7402细胞的抗癌活性［J］.中国药理学通报，2014，30（6）：887－8.

［4］ Mourboul A，Wang Y B，Xu F Y，Abulizi A.Anticancer property of isoliquiritigenin and 3-oximethyl-isoliquiritigenin in human Bel-7402 hepatoma cell lines［J］.Chin Pharmacol Bull，2014，30 （6）：887－8.

Effects of conjugated linoleic acid isomers on inhib-iting proliferation of MCF-7 human breast cancer cells and promoting apoptosis

SUN Li-ting1，LIU Ping2，LI Jia-xiao1，LI Xiang-min1，LI Hai-xing1，LIU Xiao-hua1
（1.Sino-German Joint Research Institute，Key Laboratory of Food Science，Nanchang University，Nanchang 330047，China；2.Yangzhou No.1 People’s Hospital，Yangzhou Jiangsu 225009，China）

conjugated linoleic acid；isomer；MCF-7；human breast cancer；cell proliferation；inhibit；promote apoptosis

孙丽婷（1989－），女，硕士生，研究方向：食品质量与安全，E-mail：907744588＠qq.com；刘晓华（1973－），男，博士，研究员，通讯作者，E-mail：li-uxiaohua＠ncu.edu.cn

时间：2016－2－26 10：20 网络出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160226.1020.058.html

10.3969/j.issn.1001－1978.2016.03.029

A

1001－1978（2016）03－0443－02

R329.24；R329.25；R737.902.2；R916.4；R979.1

2015－09－14，

2015－11－18

国家自然科学基金资助项目（No 31260373）；江西省自然科学基金资助项目（No 2013ZBAB205004）