化学发光技术在人兽共患病诊断中的应用

刘泽众,李扬帆,常惠芸



化学发光技术在人兽共患病诊断中的应用

刘泽众,李扬帆,常惠芸

中国农业科学院兰州兽医研究所 家畜疫病病原生物学国家重点实验室 国家口蹄疫参考实验室，兰州730046，Email:907222118@qq.com

摘要:化学发光技术是一种极其敏感的新型检测技术。本文阐述了化学发光技术的原理与类型,介绍了可应用于化学发光检测技术中的纳米、磁珠、生物传感器等相关新型技术，同时对当前该技术在人兽共患病、动物疫病诊断中的最新应用做了报道，最后提出了未来几年化学发光检测技术的发展前景。

关键词：化学发光;动物疫病;人兽共患病;检测

由于各种疫病诊断的需要，在近50年内，各种诊断技术迅速发展。快速、准确、高效的诊断技术对于社会、经济、人类生活的发展十分重要。Yallow等[1]于1961年发明了放射性免疫(Radioimmunoassay,RIA)诊断的方法，该方法开创了检测微量物质的先河。但放射性免疫会产生放射性污染,因此在放射性免疫的基础上逐渐建立了化学发光(Chemiluminescence, CL)检测技术。化学发光具有高的敏感性和信噪比、低的背景荧光信号、宽的线性范围，能够通过发光检测仪器定量分析被检样品等诸多优点而在生命科学的各领域广泛应用[2]。近几年来，纳米、磁珠、试纸条层析、生物传感器、流动注射系统、毛细管电泳、以及高效液相色谱等技术不断发展，极大推动了化学发光技术的更新换代。在当前的各种化学发光检测研究中，如何进一步缩短检测时间、减少检测费用、增加检测敏感性与特异性、实现多组分同时检测和现场检测成为了研究的热点[3]。

1化学发光的原理

化学发光剂分子在化学反应过程中因受到某些催化剂或氧化剂的作用获得能量,而从基态跃迁到激发态，但处于激发态的分子不稳定，当该分子重新跃迁回到基态时,伴随着以光子的形式释放出能量,从而产生了化学发光[4]。因此化学发光不需要任何激发光源，消除了激发光源的散射，降低了背景荧光信号，可以在很宽的线性范围内检测极低浓度的分析物[5]。将化学发光应用于免疫反应和核酸杂交分析可极大提高检测的灵敏性。

2发光剂的种类

2.1鲁米诺(luminuo)及其衍生物鲁米诺是最早使用的发光剂，起初被用来直接标记生物大分子，然后通过与过氧化氢反应产生化学发光，从而起到辅助检测的作用。但该化学反应缓慢，发光强度较弱，时间较短，常常需要在催化剂和发光增强剂的作用下进行，因此当时没有广泛应用。后来由于辣根过氧化酶(horseradish peroxidase,HRP)可以催化鲁米诺发光，因此人们用辣根过氧化酶标记生物大分子，待反应结束后，除去未结合的辣根过氧化酶，再加入足量的底物鲁米诺产生化学发光。该方法提高了发光强度，延长了发光时间，是目前使用最为广泛的化学发光系统。

2.21,2-二氧环乙烷衍生物(AMPPD)AMPPD是碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)的底物。同样将碱性磷酸酶标记生物大分子，待反应结束后加入足量的AMPPD引发化学发光。由于ALP-AMPPD无论在液相与固相检测中都具有很高的灵敏度，而成为目前最重要的发光体系之一。

2.3吖啶酯吖啶酯(acridinium ester,AE)是一种重要的化学发光试剂，在临床免疫检测、核酸分析、环境样品检测中已经应用了40多年[6]。同其它发光剂不同，吖啶酯可以直接标记生物大分子，在碱性溶液如过氧化氢的作用下就可发光，且具有发光强度高、发光时间长的优势。

2.4三联吡啶钌三联吡啶钌(Ru(bipy)3+)是电化学发光(Electrochemiluminescence,ECL)的标记物。Hercules等[7]于1964年首次报道了电化学发光技术，其基本原理是应用三联吡啶钌在阳极表面与电子供体三丙胺(TPA)进行电子转移，最后引发持续稳定的发光。近些年来，电化学发光常与其他检测技术联合应用，如高效液相色谱、流动注射系统、免疫传感器等。其中电化学发光与免疫传感器联合应用最为广泛，该应用结合了电化学发光的高敏感性和免疫反应的高特异性，可以通过简单的仪器量化信号，极大地方便了生物检测[8]。

3化学发光最新相关技术

3.1纳米技术随着纳米生物学的发展，纳米技术在生物医学中的应用越来越受到科研工作者的青睐[9]。近些年来，基于纳米的化学发光检测技术不断发展。纳米技术在化学发光技术中的应用克服了放射性免疫安全性差(RIA)、荧光免疫灵敏度低(fluorescence immunoassay,IFA)、酶联免疫(enzyme-linked immunoassay,ELIA)稳定性差的问题[10]。其中磁性纳米颗粒、金属纳米颗粒、氧化石墨烯等新型纳米材料在化学发光中的应用显现出了很好的效果。

磁性纳米颗粒具有良好的生物相容性与吸附性能，且能够在外加电场的作用下迅速从反应混合物中分离出来，因而受到广泛的关注。目前磁性纳米颗粒已经广泛应用在核酸和蛋白纯化[11]、免疫反应[12]、磁共振成像[13]、药物传递[14]等生物学的各领域。

金纳米具有许多独特的性质，1)比表面积大：可作为载体承载大量的生物分子或化学发光剂；2)功能多样化：不同大小、形状的金纳米具有不同的性质；3)表面易于修饰：可通过共价结合或静电作用与生物大分子结合；4)催化作用：可直接催化鲁米诺-硝酸银，鲁米诺-过氧化氢系统的化学发光；5)光学作用：表面等离子体共振现象[15-16]。基于金纳米的化学发光有两种途径，一种为金纳米作为载体承载例如鲁米诺、抗体、生物素等大分子来放大化学发光信号，另外一种为金纳米作为催化剂直接放大化学发光信号[17]。目前金纳米已经广泛用于检测蛋白质[18]与DNA[19]等。

氧化石墨烯是一种新型的纳米材料,它不仅具有纳米材料的诸多优点，还可以猝灭吖啶酯-过氧化氢系统产生的化学发光，因此应用该特点可以发展均相化学发光检测方法。

3.2免疫传感器技术免疫传感器在兽医和临床诊断中是一个非常有用的工具。免疫传感器包括两部分,一部分为生物受体即抗原或抗体,用来捕获分析物；另一部分为换能器,用来把识别到的分析物转换成可定量的信号。将免疫传感器与化学发光结合可实现检测的自动化。然而，在设计免疫传感器的过程中，如何把抗原或抗体固定到换能器上是非常重要的，好的固定方法可以增加检测的敏感性[20]。

3.3流动注射和毛细管技术免疫反应需要很多培育与洗涤步骤。相对于静态的免疫反应，流动注射免疫反应实现了自动化，减少了手动操作的环节，大大缩短了检测时间[21]，将其与化学发光技术联合应用可实现对临床样品的自动化、高通量检测。而毛细管技术与化学发光联合应用也具有多种优点，最主要的是该方法操作简单，通过便携的生物传感器可实现现场检测的目的。

3.4试纸条与微流控技术传统的流动注射技术虽然具有诸多优点，但会造成大量贵重试剂的浪费，不仅使检测成本增加，同时也可能造成环境的污染，而微流控技术可以很好的克服这个缺点[5]。微流控技术是在直径为微米单位的管子中进行样品的准备、混合、反应、分离、分析、定量[22]。Martinez等[23]于2007年第一次研制出了基于试纸的微流控分析仪器。由于该方法充分利用了微流控的高效性与试纸条的简便性，使之成为目前最廉价的检测方法之一。该方法具有多种优点：1)所需样品少，可准确分析复杂样品。2)可高通量快速检测。3)通过微流控技术，传感器可以与试纸结合，使定量分析被检样品成为可能。4)适合现场检测。

4相关人兽共患病化学发光检测方法

化学发光检测技术在人兽共患病的诊断中已经广泛应用。人兽共患病病原如禽流感(avian influenza)H1N1病毒、乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)、戊型肝炎病毒(hepatitis E virus, HEV)、布鲁氏菌(Brucella)、结核杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)、李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、耶尔森氏菌(Yersinia)等的化学发光检测方法近几年都有报道。

4.1禽流感H1N1病毒化学发光检测方法Li等[24]结合了磁性纳米颗粒技术、生物素-亲和素系统、HRP催化鲁米诺的化学发光、杂交反应、PCR等方法建立了检测禽流感H1N1病毒DNA的方法。该方法是将磁珠羧基化，与氨基化的探针连接，然后对禽流感H1N1病毒的DNA片段进行PCR扩增，将PCR扩增产物与磁珠探针进行杂交，在外加电场的作用下，杂交物被快速分离出来，再加入生物素标记的报告DNA进行杂交反应，最后加入标记有亲和素的辣根过氧化物酶，通过亲和素-生物素反应使辣根过氧化酶连接到PCR扩增产物上，在底物鲁米诺-双氧水系统中产生化学发光反应。该研究用对碘苯酚作为增强剂进一步延长发光时间，最后通过对各种反应条件的探索优化，对禽流感H1N1病毒DNA的检测极限可以低至0.1 pmol/L。相比于之前的检测方法，该方法的敏感性更高。

4.2乙肝表面抗原(HBsAg)化学发光检测方法Shourian等[17]建立了检测乙型肝炎表面抗原的化学发光检测方法。该方法将生物素与鲁米诺共价结合到金纳米表面，并将链亲合素与抗HBsAg抗体偶联，待该抗体捕捉到HBsAg后，通过生物素-亲和素反应，使金纳米-鲁米诺共轭物结合在免疫复合物上。由于链亲合素是一个四聚体蛋白，因此不止一个亲和素可以与其结合，导致了大量的鲁米诺结合在复合物上，从而极大地提高了检测的灵敏性。该方法的检测极限可低至0.36 pg/mL。Xiang等[25]建立了毛细管化学发光检测乙肝病毒表面抗原(HBsAg)的方法。该方法用便携式的分析仪可在25 min内定量检测出人血清中的HBsAg，其线性范围为0.4～15.0 ng/mL,灵敏度为0.3 ng/mL, 特异性高达100%。相比于其他的微载体化学发光检测法，该方法通过与毛细管技术结合，可实现现场快速检测的目的。并且可进一步应用到人兽共患病的诊断中去。

4.3 结核杆菌化学发光检测方法He等[26]人建立了检测结核杆菌DNA的化学发光检测方法。由于在普通的检测中，复杂的标记方法以及分离、洗涤步骤不仅耗时多，而且还显著影响检测的灵敏性。利用氧化石墨烯可以克服上述缺点，使得在检测过程中不需要对DNA探针进行标记，也无需分离和洗涤步骤。其基本的检测过程在均质的液相中进行，在没有目标DNA时，DNA探针和吖啶酯通过静电作用被吸附在氧化石墨烯表面上，此时由于氧化石墨烯可以猝灭吖啶酯产生的化学发光，使得发光强度很弱。但当加入目标DNA后，DNA探针与目标DNA杂交形成双链，使DNA探针构象发生改变，继而从氧化石墨烯表面释放出来。此外，双链DNA对吖啶酯具有强大的离子吸附能力，也能使吖啶酯从氧化石墨烯表面释放出来，从而脱离了氧化石墨烯的猝灭作用，使化学发光强度显著增强。利用这个方法检测结核杆菌DNA，检测极限可低至0.65 nmol/L，显著低于之前报道的电化学发光检测法。

4.4布鲁氏菌化学发光检测方法Liebes等[27]用光纤作为换能器设计出了检测抗布鲁氏菌抗体的化学发光免疫传感器。该方法通过用各种硅烷、二苯甲酮衍生物作为硅烷偶联剂，使布鲁氏菌颗粒固定到光纤上。然后对应用各种硅烷化试剂的光纤化学发光免疫传感器(CL-OFIS)、比色ELISA、CL-ELISA进行了比较。结果发现以DCBZS(4-(3′-dichloromethylsilyl)propyloxybenzophenone)修饰的CL-OFIS检测抗布鲁氏菌IgG抗体的最低检测限为0.207 μg/mL，明显低于比色ELISA的检测极限0.828 μg/mL和CL-ELISA的检测极限0.414 μg/mL。此外，CL-OFIS较传统的ELISA耗时少，操作程序简单,更加适合现场疫病的诊断。

4.5戊型肝炎和耶尔森氏菌化学发光检测方法Klaus[28]等通过将流动注射技术与化学发光免疫芯片结合起来，可实现同时检测猪血清中是否含有戊型肝炎病毒和耶尔森氏菌。该研究将戊型肝炎抗原O2C-gt1、O2C-gt3和耶尔森氏菌外活性蛋白D组成重组抗原固定到载玻片上，用显微阵列分析平台MCR3 (MCR3结合了化学发光和流动注射系统)来检测抗戊型肝炎病毒和抗耶尔森氏菌的IgG抗体。该方法可在9 min内自动完成检测过程，其特异性和重复性都明显高于ELISA。

4.6李斯特菌化学发光检测方法Liu等[29]第一次将试纸微流控化学发光检测技术与简单的电荷耦合器(charge-coupled device CCD)结合，减少了检测时间且降低了检测成本。该方法利用对碘酚来加强辣根过氧化酶-鲁米诺-双氧水系统的化学发光，并且改变了蜡丝网印刷的方法，降低了加热温度，减少了能量的消耗。最重要的是该方法巧妙地利用折纸的方法构建了微阀门，使加样和洗涤步骤更加方便，同时降低了交叉污染的可能性。用该试纸微流控化学发光传感器来检测由李斯特菌靶向hlyA基因扩增而来的198 bp的DNA，在最优条件下，线性范围为1.94×10-1pmol/L～1.94×104pmol/L,最低检测限为6.3×10-2pmol/L，相比于其它的基于CCD微流控化学发光检测DNA的方法低3-5个数量级。

4.7多种腹泻病原化学发光检测方法Wang 等[30]利用PCR、亲和素-生物素系统、DNA杂交、辣根过氧化酶催化的化学发光等技术可对多种腹泻病原同时进行高效检测。该方法用戊二醛连接氨基化的载玻片和氨基化的DNA探针，然后从肠出血性大肠杆菌、霍乱弧菌(Vibriocholerae)、志贺氏杆菌(Shigella)、沙门氏菌(Salmonella)中分离出6组基因，用多重PCR同时扩增3组基因。在每个检测单位中，同时加入3个基因的扩增产物，可实现多组分同时检测。检测最低限为0.75 nmol/L，该方法也可进一步应用到现场检测中。Liu等[31]将连接依赖性PCR应用到上述基于亲和素-生物素、磁性纳米颗粒的化学发光检测系统中可实现对基因拷贝数定量检测。由于连接依赖性PCR和磁性纳米技术的应用，使信号进一步得到了放大，从而增加了对基因拷贝数检测的敏感性。

5相关动物疫病化学发光检测方法

近几年来关于化学发光检测技术在动物疫病诊断中的应用只有圆环病毒(porcine circovirus, PCV)、猪细小病毒(porcine parvovirus virus, PPV)、伪狂犬病毒(Pseudorabies virus, PRV)等几篇报道。

5.1猪细小病毒化学发光检测方法Zhou等[32]将检测抗体和辣根过氧化酶同时固定在金纳米上作为纳米探针，建立了快速检测猪细小病毒的化学发光检测方法。在最优条件下，阳性血清在稀释1∶80～1∶5 120倍时呈线性关系，在稀释1∶10 240(S/N=3)时为检测最低限，相比于ELISA的检测极限(1∶160，S/N=3)要低很多。此外，为了分析金纳米的优越性，该研究对以金纳米为载体的化学发光检测方法和普通的化学发光检测方法进行了比较，两种方法分别对1∶200倍稀释的阳性血清进行了检测，得到的信噪比分别为54.1和29.4。这说明以金纳米为载体能显著提高化学发光检测的敏感性。

5.2猪圆环病毒化学发光检测方法Zhang等[33]通过用羟氨放大金纳米颗粒反应来增强化学发光信号，建立了高效检测2型猪圆环病毒的化学发光检测方法。在最优的实验条件下，检测极限可以低至2.67×102copies/mL。同时该实验检测了36份临床血清样品，与PCR法比较，该方法有较高的敏感性和特异性，可以进一步应用到其他疾病的诊断中去。5.3伪狂犬病毒化学发光检测方法Yang等[34]基于上述磁性纳米颗粒的作用原理建立了高效检测伪狂犬病毒的化学发光检测方法，其检测极限可低至100 amol/5 pM。

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DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.05.013

中图分类号：R372

文献标识码：A

文章编号：1002-2694(2016)05-485-05

Corresponding author:Chang Hui-yun, Email:changhuiyun@126.com

收稿日期：2015-03-17修回日期：2016-02-22

Application of chemiluminescence for diagnosis of zoonoses

LIU Ze-zhong, LI Yang-fan, CHANG Hui-yun

(StakeKeyLaboratoryofVeterinaryEtiologicalBiology/NationalFoot-and-MouthDiseasesReferenceLaboratory/LanzhouVeterinaryResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Lanzhou730046,China)

Abstract:Chemiluminescence is a new and extremely sensitive technology. In this paper, we reviewed the fundamental principal and category of chemiluminescence, and described the new technologies used in chemiluminescence detection system, such as nanomaterials，magnetic beads，biosensors and so on. Subsequently, the latest application of chemiluminescence in zoonoses diagnostics and animal diseases diagnostics has been particularly reported. Finally, the prospects of chemiluminescence for the next few years are proposed．

Key words:chemiluminescence; animal diseases; zoonoses; detection Supported by the China Agriculture Research System (No.CARS-36-06B)