MicroRNA作为阿尔茨海默病标志物的研究进展

杨婷婷 刘辰庚 王培昌

(首都医科大学宣武医院检验科，北京 100053)



MicroRNA作为阿尔茨海默病标志物的研究进展

杨婷婷 刘辰庚 王培昌

(首都医科大学宣武医院检验科，北京 100053)

阿尔茨海默病；脑脊液miRNA；血清miRNA；AD标志物

阿尔茨海默病(AD)是一种慢性的神经系统退行性疾病，早期症状表现为短期记忆丧失、失语、方向感下降，随着病情的发展会出现各种神经精神症状，行为异常，生活不能自理，直至死亡〔1,2〕。随着社会发展,老龄化速度的加快,AD的患病率也逐渐上升〔3〕。据统计，全世界65岁以上人口患有AD为5 000多万,并且估算2020年将增加50%〔3,4〕。我国AD人数达500万，数据显示，60岁人群中患病率为5%，80岁为20%〔5〕。目前AD已经成为威胁老年人健康的第四大杀手，其死亡率仅低于心脑血管疾病、肿瘤和脑卒中，严重危害老年人的身体健康和生活质量〔6〕。由于AD发病时间较晚，并且没有特异性指标，早期很容易被忽略，很多患者被确诊时已发展至痴呆阶段。而患者一旦进入痴呆阶段，将面临无有效治疗方法可用的尴尬。故力求在痴呆前阶段对AD进行诊断和预警并进行治疗干预已成为AD学界的共识。

1 MicroRNA与AD

MicroRNA(miR)是一种长度为20～24个核苷酸的5'端带磷酸基团、3'端带羟基的内源性非编码小RNA，在生物体内具有重要作用。利用生物信息学的方法估计生物体内约有1/3编码蛋白的基因受miR的调控〔7〕。已有多项研究表明，miR与AD有很重要的关系。miR在细胞实验中能调节淀粉样前体蛋白(APP)的表达及影响Aβ沉积〔8～11〕，在AD的转基因小鼠模型里也检测到miR对AD的影响〔12,13〕。miR还能够影响Tau蛋白的过度磷酸化〔14〕,细胞外信号调节激酶(ERK1)被认为是Tau蛋白磷酸化过程中的关键酶，在鼠的神经细胞中miR-15家族能调节ERK1的表达，从而影响Tau蛋白磷酸化的过程。而在AD患者的脑中miR-15家族的表达量明显减少，可见miR通过影响Tau蛋白的磷酸化在AD的发病过程中起着重要的作用〔15〕。故miR可能成为AD治疗工具和诊断特别是早期诊断的标志物。

2 脑脊液 miR检测分析及研究进展

早在2008年，Cogswell等〔16〕通过实验和查文献等方法揭示了脑内变化的miR可通过淀粉样作用、神经生成、胰岛素抵抗及先天性免疫方面的途径影响AD的发病机制；而且发现CSF的miRs和脑内miR的变化一致；脑脊液又具有取材方面的优点，因此在脑脊液中寻找特异性miRs是可行的，为寻找诊断AD 的早期标志物带来了一种思路。

2013年，胡国艳等〔17〕利用miR芯片就10例AD患者和认知正常老年人脑脊液的miR表达谱进行检测和初步生物信息学分析，用Real-Time PCR验证miR芯片检测结果。结果miR芯片检测发现，在AD患者和认知正常老年人脑脊液中共有128个差异表达miR，其中63个上调，下调65个；另外，应用Real-Time PCR对miR-125b和miR-132这2个上调miR进行了验证，结果与芯片检测结果一致，因此认为AD患者脑脊液具有特异性的miR表达谱，提示可能在 miR表达环节找到新的AD分子标志物。

2014年，Kiko等〔18〕用qRT-PCR的方法检测了6种(miR-9、miR-29a、miR-29b、miR-34a、miR-125b和miR-146a)在AD患者脑中变化很大的miR，据报道，AD患者脑中miR-29a和miR-29b的减少，导致了脑中BACE1表达的增加，然而在本实验中发现，AD患者的脑脊液中miR-29a和miR-29b明显高于正常对照组，因此猜想脑脊液中miR-29a和miR-29b可能来源于大脑，这些miRs可能是AD患者的大脑中分泌到脑脊液中去的，但是具体的原因仍待进一步证实。miR-34a、miR-146a和miR-125b在AD患者脑中明显升高，但在本实验中发现miR-34a、miR-146a和miR-125b在AD患者脑脊液中是显著减少的。因此认为AD患者脑中miR-34a、miR-146a和miR-125b是不能被分泌到发现AD患者脑脊液中的。同样在AD患者脑中富含miR-9，但是在AD患者脑脊液却没有miR-9水平的变化。提示可能是这些miR的释放方式不同。这个实验为进一步探索脑脊液中AD分子标志物提供了可能。

2015年van Harten等〔19〕发现miR-139-5p、miR-519-3p和miR-181-5p在AD病人的脑脊液中表达水平比较低，而miR-590-5p和miR-223-5p在AD病人的脑脊液中表达水平增高。在65岁以上的迟发性AD中，7种miR呈现出明显的不同，在65岁以下的早发型AD中12种miR呈现出明显的不同miR-532-3p在早发型AD中有重要作用。经过各种实验证实，认为在迟发性AD中let-7a最可能成为标志物，并认为let-7a功能上可能与APP的表达有关。而在早发型AD中则认为miR-532-3p最可能。

同年Müller等〔20〕通过定量PCR，检测脑脊液中miR-27a、miR-29a、miR-29b和miR-125b的含量及通过血细胞刺激法分析发现，在无细胞的脑脊液中，miR-27a的水平与对照组无明显差异，这与之前研究的AD病人脑脊液中miR-27a的表达水平降低是不同的，一种可能的原因是脑脊液中细胞的影响。而AD病人无细胞脑脊液中miR-29a的表达水平是显著上调的，有效区别了对照组与AD患者。但是当脑脊液中有血细胞影响时，miR-29a的表达水平却出现明显下降。AD病人无细胞脑脊液中miR-125b是轻微上调的，但是它基本不受脑脊液血细胞的影响。而且实验发现miR-27a和miR-29a的水平受脑脊液中血细胞的影响是十分迅速的，这对腰穿检测无细胞脑脊液中这些miR带来了巨大的挑战，尽管如此，miR-29a还是一个有希望的AD 分子标志物〔20〕。

3 血清 miR检测分析及研究进展

在2012年有学者研究发现在大部分AD患者的血清中miR-137、miR-181c、miR-9、miR-29a和miR-29b的水平下调〔21〕，为寻找血清学AD诊断标志物提供了依据，2014年Tan等〔22〕用qRT-PCR的方法对miR-9、miR-29a、miR-29b、miR-101、miR-125b和miR-181c进行分析，结果发现miR-125b和miR-181c的水平下调，而miR-9的水平是上调的。并且绘制受试者工作特征曲线显示miR-125b具有68.3%的特异性和80.8%的敏感性，更重要的是血清中miR-125b的水平与AD患者的MMSE评分呈负相关。因此认为miR-125b可能成为AD的无创血清标志物。

2014年，Tan等〔23〕用qRT-PCR的方法检测了6种(miR-98-5p、miR-885-5p、miR-483-3p、miR-342-3p、miR-191-5p和let-7d-5p)在AD患者与对照组具有明显差异的miR。其中miR-342-3p的改变最具敏感性和特异性，且血清中miR-342-3p的含量越高，患者的认知能力下降越严重，病程越长，这可能对疾病的发展和预后判断提供了帮助。2015年Xie等〔24〕用qRT-PCR方法定量检测了miR-206、miR-132、miR-193b、miR-130b、miR-20a、miR-296和miR-329的水平，发现miR-206和miR-132在MCI患者血清中明显升高；ROC曲线分析发现miR-206和miR-132的联合检测产生最大的曲线下面积。他们还应用TargetScan等生物信息检索系统预测靶基因，用DAVID方法识别生物学过程。生物信息显示BDNF和SIRT1是miR-206和miR-132的靶基因。在MCI的患者血清中BDNF和SIRT1的表达下调与miR-206和miR-132的上调是一致的。BDNF 和 SIRT1与学习和记忆功能有关。因此认为miR-206和miR-132的联合检测可能成为MCI患者的最佳血清学标志物。同年，Dong〔25〕又用高通量测序技术筛查了AD与正常对照组血清中的miR的表达情况，并在个体水平用RT-qPCR方法证实了发生改变的miR。结果显示与对照组相比，AD患者血清中有四个miR(miR-31、miR-93、miR-143和miR-146a)发生显著性降低。应用ROC曲线分析方法显示这四种miR可能成为AD潜在的标志物。

4 外吐小体内miR检测对AD诊断的价值

2015年，本实验室使用超速离心法提取痴呆期AD患者(DAT)、轻度认知障碍患者(MCI)和健康对照组血清和脑脊液外吐小体并检测其miR-193b水平。结果发现MCI和DAT患者脑脊液及血清外吐小体内miR-193b水平均低于对照组，且DAT组低于MCI组，差异均有统计学意义〔26〕。因此认为血清外吐小体内miR-193b可能为AD，特别是早期诊断AD的标志物。但该研究仍属于小样本研究且未纳入pre-MCI受试者，因此外吐小体内miR是否能够成为AD的早期诊断标志物有待于进一步研究。

体液miR的来源众多，包括凋亡和坏死的组织细胞的miR释放。细胞的被动渗漏和主动分泌等〔27〕。人体中运输miR的载体主要包括蛋白；脂蛋白以及微囊泡和外吐小体等。其中外吐小体可在分泌细胞的支配下主动转运特定的miR，此类循环miR可看做是某些细胞经由外吐小体这一载体向靶细胞发送的信息，那么他的表达是否具有专一性，能否成为AD检测的标志物呢，有待于我们去研究。

而且虽然目前尚无直接的证据证实miR能自由的通过血脑屏障，但研究表明组成血脑屏障的细胞可主动分泌微囊泡和外吐小体〔28,29〕，这些微囊泡和外吐小体内可能包含有脑组织向外周组织或是外周组织向脑组织所传递的信号。因此，了解外吐小体内miR表达水平的变化可能较体液总miR测定更有利于疾病的诊断和治疗监测。

5 结 语

越来越多的研究表明，体液miR对于AD的诊断和治疗具有较大的潜在价值〔30,31〕。虽然CSF直接接触脑组织，较血液尿液而言其更能反映中枢系统的病理生理改变，但临床医生和检验工作者不得不面对的是，对于已经出现明显临床症状的AD患者，其神经心理学评分往往已经出现异常，这时对其进行CSF的抽取和检验往往得不到患者和家属的认可。故血液、尿液等较易获得的体液标本中是否存在能作为AD特别是早期AD检测标志物将成为AD诊断研究领域的一个热点。

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〔2016-01-19修回〕

(编辑 曲 莉)

国家自然科学基金青年基金(No.81401734)

王培昌(1965-)，男，教授，博士生导师，主要从事衰老及相关疾病机制研究及标志物筛选。

杨婷婷(1992-)，女，硕士，主要从事衰老及相关疾病标志物筛选研究。

R741.02

A

1005-9202(2016)20-5190-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.20.124