盖他病毒的诊断及研究进展

邹云婧，梁中银，张 姗，郑英帅，袁万哲,4,5*，孙继国,4,5*

（1．河北农业大学动物医学院，河北 保定 071001；2．河北农业大学动物科技学院，河北 保定 071001；3．天津市动物卫生监督所，天津 300211；4．河北省兽医生物技术工程技术研究中心， 河北 保定 071001；5．农业部动物疫病病原生物学华北区观测实验站，河北 保定 071001）

盖他病毒的诊断及研究进展

邹云婧1，梁中银2，张 姗1，郑英帅3，袁万哲1,4,5*，孙继国1,4,5*

（1．河北农业大学动物医学院，河北 保定 071001；2．河北农业大学动物科技学院，河北 保定 071001；3．天津市动物卫生监督所，天津 300211；4．河北省兽医生物技术工程技术研究中心， 河北 保定 071001；5．农业部动物疫病病原生物学华北区观测实验站，河北 保定 071001）

盖他病（Getah，GET）是由披膜病毒科甲病毒属的盖他病毒（Getah virus，GETV）引起的主要侵害猪和马的一种虫媒传染病。盖他病毒可引起母猪繁殖障碍，导致妊娠母猪流产、产死胎或弱仔。该病毒在亚洲地区、澳大利亚北太平洋沿岸地区分布广泛，给家畜和养殖业带来了一定威胁。目前，针对盖他病毒的研究还较少，为此，笔者概述了盖他病毒的发现和分类、分子生物学特征、流行病学及临床症状、诊断技术等，拟为该病的深入研究提供相关的理论参考。

盖他病毒；分子生物学特性；流行病学及临床症状；诊断技术

盖他病毒为单链线形RNA，是披膜病毒科甲病毒属的一个重要成员。盖他病是由盖他病毒引起的一种虫媒传染病，与人畜关系密切。病毒可通过蚊子传播感染脊椎动物，主要侵害猪和马，如造成母猪繁殖障碍，妊娠母猪流产、产死胎或弱仔，并能引起马的发热、皮疹、后腿浮肿、淋巴结肿大等，同时还可感染鸟类、鼠类、爬行和两栖动物。该病毒广泛分布于亚洲和北太平洋沿岸地区，如马来西亚、中国、日本、韩国、菲律宾、泰国、澳大利亚等[1-3]，被列为重要的动物源性病原体[4-6]。但目前，针对盖他病毒的研究在国内还较少，很多机理也有待于进一步探索。为了更好地了解和掌握盖他病毒相关知识，本文对该病毒的发现及分类、分子生物学特性、流行病学及临床症状、诊断技术等方面加以综述，以为今后对盖他病毒的进一步研究和完善人畜共患病公共卫生体系及预警机制提供一定理论参考。

1 病毒的发现及分类

盖他病毒于1956年首次在马来西亚从雪背库蚊（C.gelidus）体内分离到，命名为Getah virus，原型株为MM2021[7]。此后，在日本、前苏联东部、东南亚及澳大利亚也相继分离到此病毒[8]。自病毒被发现以来，其对人和动物的传染性与致病性引起了诸多学者的关注。研究显示，在我国很多地区也有盖他病毒的分布[9]。目前，我国已经分离到的盖他病毒病原体有10株，分别为：1964年，在海南省捕捉的库蚊中分离到1株病毒，命名为M1，经鉴定为GETV[10]；王焕琴等在对河北省蚊虫进行病毒分离鉴定时发现2个毒株属于甲病毒属成员，用甲病毒属特异性引物进行RT-PCR扩增，结果呈阳性，经核酸序列测定证实从河北省蚊虫标本中分离到GETV（HB0234，HB0215），这也是首次在我国内陆地区分离到该病毒[11]；2005年，从云南省分离到GETV 2株（YN0540，YN0542）；同年，在上海分离到GETV 4株(SH05-5、SH05-15、SH05-16、SH05-17)[9]；2006年，翟友刚等在甘肃省吸血蚊虫中分离到1株GETV（GS10-2）[12]。近年来，在我国多数地区，猪盖他病毒抗体阳性率水平呈持续上升趋势，夏季尤为严重[13]。

2 病毒的分子生物学特征

2．1 形态结构与理化特性

盖他病毒为单链线形RNA，病毒颗粒呈球形，直径为60～70 nm，具有囊膜和纤突，有典型的甲病毒属基因组结构，包括糖蛋白外壳、双层类脂膜及含有RNA的核心3个基本组成成分[8]。病毒对酸（pH3.0）、碱及有机溶剂（乙醚、氯仿等）敏感[14]；在1 mol/L的MgCI2状态下，对50 ℃以上温度敏感性较强，病毒在10 ℃环境中可存活3个月，4 ℃时毒力可保留6个月。GETV对4日龄以下的小白鼠具有病原性，病毒可在各种脊椎动物和节肢动物体内增殖，且能凝集鹅、鸡、马、鼠、兔等动物的红细胞。对Vero、BHK-21等细胞系易感。

2．2 基因组与编码蛋白

病毒的基因组为单链线形RNA，长度在11～12 kb之间，具有5' 帽子结构和3' 多聚腺苷酸（Poly A）尾。其中，3' Poly（A）尾的存在与其RNA具有感染性直接相关。基因组可分为两个不同的区段，包括非结构区和结构区。前者位于基因组5’端前2/3部分， 含有7 600个核苷酸，负责编码nsP1、nsP2、nsP3和nsP4 4种非结构蛋白，主要为病毒自身复制酶，与病毒自身转录和复制有关；后者位于基因组3’末端后1/3部分，含有4 100个核苷酸，用于编码多种结构蛋白如衣壳蛋白C、外膜糖蛋白E1、E2、E3和6K蛋白等[8,15-16]，3’UTR末端19 nt保守序列与病毒的复制和存活密切相关，为病毒存活所必需[17]。

2．3 保守区核苷酸序列

在甲病毒基因组核苷酸序列中均具有4个完全相同的序列区，称序列保守区[18]。通常来说，序列越保守，功能就相对越重要。基因组5’端帽子结构后44个核苷酸围成一个带柄的环带，称为第一保守区，具有启动子的功能，负责在病毒基因组复制过程中负链RNA的合成；紧连第1保守区为第2保守区，由51个核苷酸组成，这些核苷酸形成与第1保守区相似的柄状环，功能尚不清楚；在基因组49S与26SmRNA的接合部，由24个核苷酸组成第3保守区（连接部位保守序列）；第4保守区位于基因组3’末端，其后为 Poly（A）尾，由 19 个核苷酸组成，因而也称19 核苷酸保守区。到目前为止，由于以上4个保守区序列仅在甲病毒基因组中被发现，与其他种属病毒的保守序列无交叉，因此，这些保守区核苷酸序列成为鉴定甲病毒的有力的依据和指标。

3 流行病学及临床症状

盖他病毒可对多种动物造成良性耐受且具有自我限制性的疾病。传播媒介随气候和地理的变化而改变，蚊类尤其是刺扰伊蚊（Aedes vexans）和三带喙库蚊（Culex tritaeniorh ynchus）为其主要传播媒介[3]。病毒能在媒介昆虫体内或培养的昆虫细胞中增殖，在自然宿主中主要表现为高滴度病毒血症或无任何症状，但经蚊虫传播给人或动物后，可引起病毒病的流行。猪和马是其主要宿主，且猪更为易感。猪感染该病具有明显的季节性，主要以2-10月多发，4月份阳性率开始上升，在病毒蚊虫媒介较多的7-9月达到高峰。GETV具有垂直传播的特性，可经胎盘感染传递给子代，因此，本病毒是导致初生仔猪死亡的重要原因之一。

GETV可引起猪的疾病，病猪症状表现为精神不振、食欲减退或消失、全身震颤、体温升高、腹泻、体表发红、共济失调等，严重者还可出现神经症状，甚至衰竭死亡。怀孕母猪感染盖他病毒后一般不出现临床症状，但会引起繁殖障碍，导致胚胎死亡并被吸收，从而降低母猪产仔数；妊娠前期感染该病毒可导致胚胎死亡，母猪返情，产死胎等。对脑、肺、肾、肠等病变组织进行病毒分离及血清学鉴定，结果为GETV阳性，并能在ESK细胞中出现细胞病变（CPE）作用，对无菌猪肌肉注射，其人工感染结果与自然发病病例相同，证明本病毒对猪具有感染性和致病性。

4 诊断方法

4．1 血清学检验

血清学检验技术以抗原抗体反应为基础，包括酶联免疫吸附技术（ELISA）、血凝抑制、血清中和试验(NT)、免疫荧光技术等多种血清学试验均可对GETV的抗原及抗体进行鉴定及诊断[15]。该检测方法灵活性大，在快速鉴定应用等方面优势较明显。

4.1.1 酶联免疫吸附技术 酶联免

疫吸附技术（ELISA）是一种用酶标记抗原或抗体的方法，即将抗原、抗体免疫反应的特异性和酶的高效催化作用原理有机地结合起来的技术，可敏感地检测体液中微量的特异性抗原或抗体，具有灵敏、快速、简便、经济等优势，尤其适用于大批量样品检测，是应用最广的免疫学技术。

4.1.2 间接血凝抑制试验 随着我国规模化养猪业的发展，人们对GETV的诊断提出了更高的要求，但由于客观条件所限，一些对于技术要求较高的诊断方法还较难普及运用，相比之下，血凝抑制试验具有方便、快捷的特点，实用性较高。

4.1.3 血清中和试验 中和试验(NT)是将抗体与毒素或病毒相结合，从而导致毒素失去毒性或者病毒失去传染力的一种免疫学试验。试验多采用细胞培养，具有方便、经济等特点。中和抗体具有高特异性，且可维持较长时间。目前，应用最广泛的是免疫荧光中和试验，具体操作是在定量病毒中加入不同稀释度的血清。

4.1.4 免疫荧光技术 免疫荧光技术包括直接免疫荧光和间接免疫荧光2种方法。该方法优点是快速、敏感、特异，与放射免疫法相比，荧光免疫法无放射性污染，并且易于操作，便于推广；缺点是成本较高。

4.1.5 琼脂扩散试验 琼脂扩散试验为可溶性抗原与相应抗体在含有电解质的半固体凝胶(琼脂或琼脂糖)中进行的一种沉淀试验，即可溶性抗原与相应抗体特异性结合，两者在比例适当并有电解质存在及一定的温度条件下，经一定的时间，可形成肉眼可见的沉淀物。该法操作简单，但敏感性较差。

4．2 分子生物学技术

4.2.1 RT-PCR技术 RT-PCR又称逆转录PCR，是将RNA的逆转录（RT）与cDNA的聚合酶链式扩增反应（PCR）相结合的技术。其原理是根据病毒DNA序列，设计特异性引物来扩增样品中待检测病毒的DNA片段，再通过电泳、染色把它显示出来。RTPCR技术高效、灵敏、特异，用途广泛。该方法可用于检测细胞/组织中基因表达水平、细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列等。

4.2.2 用荧光蛋白基因构建复制子缺损的表达载体进行瞬时表达分析梁国栋[19]等利用此法，通过构建出的的质粒来对用来盖他病毒进行定性或定量检测分析[20]。

5 展望

目前，对盖他病毒的研究仍较有限，很多机制机理尚不清楚，其危害及影响程度亦不可预知。而近年来，在我国多数地区的蚊虫中相继分离到GETV，因此，有必要对GETV加强研究力度，明确其发病机理，诊治及防控方法，同时建立完善的GETV乃至其他虫媒病毒的监测系统，加强对GETV的分离、基因特性及毒株抗原性研究，以便制备有效疫苗，对其危害作出评估，为科学防控GET提供依据。

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邹云婧（1990-），女，硕士研究生，研究方向为预防兽医学，E-mail:yunjingzouz@163.com

袁万哲（1978-），男，副教授，博士，E-mail: yuanwanzhe@126.com

孙继国（1956-），男，教授，博士，博士生导师，E-mail: vaccine2000@126.com